手术单、手术衣和洁净服生物负载水平测定方法介绍

王文庆，张步增，吴 平

山东省医疗器械产品质量检验中心，济南市，250101

手术单、手术衣和洁净服生物负载水平测定方法介绍

【作 者】王文庆，张步增，吴 平

山东省医疗器械产品质量检验中心，济南市，250101

该文首先对手术单、手术衣和洁净服产品生物负载的定义、生物负载测定的意义以及指标要求进行了阐述；随后，主要针对生物负载水平的评价方法选择以及确认进行具体介绍。

手术衣；手术单；洁净服；生物负载；洁净度-微生物；回收率；修正系数

所谓生物负载（bio-burden），是指产品上存活微生物的总数。在YY/T 0506手术单、手术衣和洁净服系列标准中，生物负载又称为 “洁净度-微生物”（cleanliness-microbial），它反映的是待灭菌的手术单、手术衣和洁净服产品的微生物污染情况，可为以下方面提供信息：

(1) 手术衣、手术单和洁净服原料生产厂家向其用户证实原料是在良好的微生物控制环境下生产的；

(2) 需进行辐照灭菌的手术衣、手术单和洁净服产品的灭菌过程确认和常规控制；

(3) 非无菌供应手术衣、手术单和洁净服产品生产厂家向其用户证实的微生物污染控制要求已得到满足；

(4) 无菌供应手术衣、手术单和洁净服产品的灭菌过程控制中，作为对净化设施、人流、物流控制系统保持产品洁净的综合能力的监视手段之一。

YY/T 0506手术单、手术衣和洁净服系列标准规定了手术单、手术衣和洁净服产品的生物负载水平为lg(CFU/dm2) ≤2。每dm2产品上最多只允许100 CFU的微生物存在。

YY/T 0506手术单、手术衣和洁净服系列标准同时规定[2]，应按照ISO 11737-1标准和该标准附录中的袋蠕动法进行微生物试验以评价产品的洁净度-微生物。但是ISO 11737-1标准只给出了生物负载测定方法设计要求以及对所设计的方法进行确认的指南。并没有针对手术单、手术衣和洁净服产品给出具体的测定方法。

对此，我们根据ISO 11737-1的要求设计了一套符合手术单、手术衣和洁净服产品特点的洁净度-微生物测定方法。该方法的技术路线是：(1) 设定适宜的洗脱程序，采用袋蠕动法对试样上自然污染的微生物进行洗脱，对洗脱液进行薄膜过滤，并对滤膜进行培养计数，得到试样上洗脱的微生物总数；(2) 以产品接种的方式将一定数量的需氧芽孢接种到灭菌后的相同试样上，用相同程序进行操作，得到洗脱芽孢总数，用接种芽孢总数和洗脱芽孢总数求得修正系数；(3) 通过修正系数对试样上洗脱的微生物总数进行修正，从而确定试样的生物负载水平。

1 测定方法

1.1 洗脱菌落数的测定

试样洗脱菌落数测定流程图见图1。

图1 洗脱菌落数测定流程图Fig.1 Flow diagram of elution microbial population determination

用1 dm2模板以无菌操作的方式裁取三个试样，分别记为1号、2号和3号试样。将三个试样分别投入3个盛有200 mL无菌氯化钠注射液的无菌匀浆袋中，将每个匀浆袋分别放入匀浆器中，将洗脱参数设定为运行频率200 r/min，运行时间1 min，启动匀浆器对试样分别进行洗脱。以无菌操作的方式将滤膜和滤杯装载于过滤装置上，将每份体积为200 mL的洗脱液分别经两个滤膜各过滤100 mL，将滤膜菌面朝上分别贴于营养琼脂培养基平板和玫瑰红钠琼脂培养基平板上。将3个营养琼脂培养基平板置于35oC恒温培养箱中培养3 d，三个玫瑰红钠琼脂培养基平板置于28oC恒温培养箱中培养5 d。逐日观察菌落生长情况，点计菌落数[3]。

按式（1）计算每个试样洗脱的菌落总数。

式中：

Yi—第i个试样洗脱的菌落总数，单位为CFU；

Ai—第i个试样营养琼脂培养基平板菌落数，单位为CFU；

Bi—第i个试样玫瑰红钠琼脂培养基平板菌落数，单位为CFU。

i ＝ 1，2，3；

按式（2）计算三个试样洗脱的平均菌落数。

式中：

Y—三个试样洗脱的平均菌落数，单位为CFU。

1.2 修正系数的测定

修正系数测定流程图见图2。

用适宜的方法制备萎缩芽孢杆菌ATCC 9372芽孢悬液保藏备用。临用前用无菌氯化钠注射液制备接种悬液，使每0.1 mL接种悬液中含有约100 CFU萎缩芽孢杆菌芽孢。按照“洗脱菌落数的测定”部分中相同的方法进行取样，分别记为a号、b号和c号试样，用制造商推荐的灭菌方式对试样进行灭菌，备用。将三个试样分别置于直径为150 mm的无菌培养皿中，向每个试样接种0.1 mL芽孢悬液（约100 CFU），均匀涂布并使其干燥。按照“洗脱菌落数的测定”部分中相同的洗脱方法对接种试样进行洗脱。以无菌操作的方式将滤膜和滤杯装载于过滤装置上，将三份体积为200 mL的洗脱液分别进行薄膜过滤，将滤膜菌面朝上分别贴于营养琼脂培养基平板上。将三个贴有滤膜的平板置于35oC恒温培养箱中培养3 d，逐日观察菌落生长情况，点计菌落数。

图2 修正系数测定流程图Fig.2 Flow diagram of correction factor determination

按式（3）计算三个试样洗脱的平均菌落数。

式中：

X— 三个试样洗脱平均菌落数，单位为CFU；Xa— 试样a洗脱菌落数，单位为CFU；

Xb— 试样b洗脱菌落数，单位为CFU；

Xc—试样c洗脱菌落数，单位为CFU。

按式（4）计算回收率。

式中：

R— 回收率；

X— 三个试样洗脱平均菌落数，单位为CFU；

Z — 接种芽孢数，单位为CFU。

按式（5）计算修正系数。

f — 修正系数；R — 回收率。

1.3 生物负载水平（洁净度—微生物）的计算

按式(6)进行洁净度-微生物的计算。

式中：

M — 洁净度-微生物；

f — 修正系数；

Y— 三个试样洗脱平均菌落数，单位为CFU。

2 方法解释和说明

ISO 11737-1中提到，“对特定技术而言，提高回收率能增加生物负载测定的准确度。若发现回收率低于50%，应考虑技术改进或使用替代技术。应注意存在回收率不高于50%的某些情况”[4]。通过试验验证我们发现，当将匀浆器的运行频率设定为200 r/min，运行时间设定为1 min时，大部分产品能有较高的回收率。进行生物负载测定时，我们推荐优先考虑此洗脱参数。但是我们同时也发现，并不是所有的产品在此洗脱参数下都有较高的回收率，比如某些水刺无纺布产品，在此洗脱参数下就没有获得较高的回收率。所以，当有回收率低于50%的情况出现时，可考虑对洗脱参数进行调整和/或加入表面活性剂等。对个别产品，如果有足够的证据表明洗脱回收率不可能高于50%，这时应按能获得最高回收率的试验方法进行测定。

我们采用的修正系数的测定方法为ISO 11737-1中给出的产品接种法，即通过向产品接种一定数量的选定的微生物，形成人工负载，用来确立回收率。该方法建立了一个模型系统，比较适用于生物负载比较低的产品的测定。在ISO 11737-1中，除了产品接种法外还有另外一种方法——重复处理法，该方法的原理是对产品上自然存在的微生物进行重复洗脱处理，直到回收的微生物累计数量没有明显增加。每重复一次都将洗脱液从产品或产品部分上完全回收并计数，比较连续回收得到的累计结果。我们没有选择重复处理法的原因，主要是因为手术单、手术衣和洁净服产品本身是在净化条件下生产，一般情况下其自然污染率都比较低，采用重复处理法很难得到具有统计意义的试验结果，我们的验证试验也证实了这一点。

在特定产品的常规检验中，尤其是对于具有较高洗脱回收率的产品，不必每次检验都测定修正系数。在方法没有改变的前提下，可以利用已得到的修正系数进行结果计算，使检验方法得到简化。不过，建议能周期性地对回收率/修正系数进行确认。

3 总结

传统的微生物检验方法，比如药品等的微生物总数测定，其样品本身一般都可以以特定的方法溶解，得到的供试液中的微生物即可代表样品本身的微生物，一般不涉及洗脱的问题。而大部分医疗器械产品，比如本文所述的手术单、手术衣和洁净服产品，其性状决定了必须对其进行洗脱，然后才能对洗脱液进行生物负载的测定。在这种情况下，如果不对方法的洗脱率进行研究，而只是单纯地采用传统的微生物检验方法进行生物负载测定，势必导致结果的不准确。本文介绍的方法与传统的微生物检验方法的最大不同之处就是，在传统微生物检验方法的基础上引进了修正系数的概念，对传统微生物检验方法的检验结果进行修正，以得到准确的试验结果。我们希望通过本文的撰写能够帮助相关人员理解YY/T0 506中洁净度-微生物的概念，掌握手术单、手术衣和洁净服产品生物负载的测定方法，加深对ISO 11737-1标准中医疗器械生物负载测定理念和方法的理解。

[1] 国家食品药品监督管理局. YY/T 0506.2-2009 病人, 医护人员和器械用手术单、手术衣和洁净服 第2部分: 性能要求和性能水平[S].

[2] 国家食品药品监督管理局. YY/T 0506.3-2005 病人, 医护人员和器械用手术单, 手术衣和洁净服 第3部分: 试验方法[S].

[3] 中华人民共和国卫生部. 中华人民共和国药典[S]. 2010.

[4] International Organization for Standardization. ISO 11737-1: 2006 Sterilization of medical devices - Microbiological methods - Part 1: Determination of a population of microorganisms on products[S].

Introduction to Method for Determination of Bio-burden on Surgical Drapes, Gowns and Clean Air Suits

【 Writers 】Wang Wenqing, Zhang Buzeng, Wu Ping
Shandong Quality Inspection Center for Medical Devices, Jinan, 250101

surgical drapes, surgical gowns, clean air suits, bio-burden，cleanliness-microbial, recovery ef fi ciency, correction factor

R187

A

10.3969/j.issn.1671-7104.2014.02.017

1671-7104(2014)02-0138-03

2013-08-36

王文庆， E-mail: wangwenqing80@hotmail.com

【 Abstract 】Firstly, the essay introduces the definition of bio-burden, the significance of determination of bio-burden and the speci fi c performance requirements. Then, the essay introduces the method selection and validation on the bio-burden determination of surgical drapes, gowns and clean air suits.