60例直肠癌标本细胞DNA含量变化分析＊

张宇星 陈继贵 刘畅

（武汉市第八医院肛肠外科 湖北武汉 430010）

近年来，结直肠癌的发病率在中国呈逐年上升趋势，尤其是在北京、上海、广州等大中城市已成为消化道第一位的恶性肿瘤。早期结直肠癌的早期诊断及治疗能够大大提高治愈率和生存年龄。如何早期发现结直肠癌及癌前病变是国内外研究的热点问题。

DNA在细胞核内以染色体形式出现，其结构和功能的异常是正常细胞演变为肿瘤细胞的分子学基础。在很多细胞癌变过程中，染色体由整倍体演变为异倍体。染色体异倍体出现是肿瘤细胞的重要标志之一。DNA倍体定量分析仪通过测定细胞内的染色体的倍体，可检测出癌变细胞。其原理与已在临床广泛应用的流式细胞仪相同。

本研究以病理组织学诊断为标准，用全自动细胞DNA倍体分析仪对60例结直肠癌标本组织、癌旁组织、正常组织进行DNA倍体分析，比较临床诊断与常规细胞学、病理组织学、DNA细胞倍体分析相互诊断的吻合率，判断肿瘤的恶性程度、预后及DNA倍体变化之间的关系，并对该方法用于结直肠癌诊断、预后判断的临床作用进行客观评估，并可将之应用于肠道脱落细胞的检测，良恶性肿瘤鉴定，以促进结直肠肿瘤的早期诊断与治疗。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集武汉市第八医院（肛肠医院）2012年1月至6月行根治性切除的直肠癌标本共60例，所有病例均经病理诊断证实。其中男28例、女32例，年龄34～78岁，平均55岁。每例直肠癌标本分别取癌组织，距肿瘤病灶2cm取癌旁组织，距肿瘤组织10cm取正常组织，运用武汉兰丁医学高科技有限公司出品的全自动细胞DNA定量分析系统进行细胞DNA倍体定量分析。

1.2 组织标本的收集及处理 在术中标本离体后，立即在结直肠癌组织、癌旁组织及正常组织中，用细胞刷子取细胞或直接印片，每处取玻片两张，自然干燥后用95%酒精固定10min后进行Feulgen-Thionin染色，并在相同部位取组织送病检。

1.3 DNA倍体测定 采用细胞DNA定量分析系统对印片进行扫描，检测结直肠癌组织、癌旁组织及正常组织中DNA含量，以分析各部位组织中异倍体的差异性及与病检结果的符合率。

1.4 统计学处理方法 利用SPSS软件分析各部位组织中DNA异倍体含量，并与病检结果、临床病理学资料、肿瘤大体形态、浸润深度、Ducks分期、淋巴结转移、病理类型进行相关性分析。

2 结 果

2.1 不同部位组织异倍体率 根据倍体性指标将全部患者分为整倍体（包括二倍体和近二倍体）和异倍体两组。经两两之间χ2检验，癌组织中异倍体率（91.67%）明显高于癌旁组织，癌旁组织异倍体率（46.67%）高于正常组织（0%），见表1。

表1 不同部位组织异倍体率

2.2 异倍体与临床病理学之间的关系 直肠癌中DNA倍体性与大体类型、病理类型无关。然而DNA倍体性与直肠癌的浸润深度、淋巴结转移、Dukes分期等病理因素有关（P＜0.05），见表2。

表2 直肠癌中DNA倍体与临床病理因素的关系

3 讨 论

3.1 直肠癌组织中DNA异倍体率与直肠癌病理学检查的符合率 癌细胞的分裂增生处于一种不正常的状态，肿瘤细胞无限分裂增殖的实质是DNA不断复制的结果，因此常会出现DNA倍体性及增殖活性的改变。DNA二倍体含量在每个正常人类的细胞中都较稳定，当细胞发生癌变以及一些具有恶性潜能的癌前病变时，在其发展过程中可伴有细胞DNA倍体的改变。许多资料表明，结直肠癌的发生主要有两条致癌途径：（1）染色体不稳定（chromosomal instability）途径，主要特征为肿瘤细胞的非整倍体DNA含量，人类多数的散发性结直肠癌主要沿此途径而发生、发展［1～3］。（2）DNA 微卫星不稳定（microsatellite instability）途径，肿瘤细胞的DNA多为二倍体或近二倍体，人类绝大多数的遗传性非腺瘤性结直肠癌（HNPCC）和少数散发性结直肠癌的发展是由这一途径所驱使。在此途径中，80%以上的肿瘤是由于hMSH2或hMLH1这两个主要的人类DNA错配修复（mismatch repair，MMR）基因的突变及其功能蛋白的丢失所致［4、5］。

许多资料表明，DNA异倍体能反映肿瘤的生物学特性，是恶性肿瘤的特征性改变，DNA倍体含量的变化，可作为诊断癌变有价值的指标，其与肿瘤的恶性程度及预后直接相关［6］。我们应用细胞DNA定量分析系统对结直肠癌细胞DNA含量进行研究，本组60例直肠癌组织细胞异倍体作为判断指标，则诊断符合率为91.67%，但有8.33%的二倍体率，故单以DNA异倍体诊断直肠癌不够准确，不能代替病理学诊断。但其诊断符合率为91.67%，高于除病理学诊断的任何其它指标，所以我们认为DNA异倍体（DNA aneuploid）可作为判断结直肠癌的重要标志（tumor marker），DNA倍体检测是对病理学诊断的有益补充。

3.2 直肠癌癌组织中异倍体率与临床病理资料的关系 本组资料中，60例肿瘤标本中55例检出异倍体，异倍体率（91.67%）显著高于癌旁组织（46.67%）、正常组织（0%）。本研究结果显示癌组织中异倍体率显著高于癌旁组织（P＜0.01），癌旁组中异倍体率也显著高于正常组织（P＜0.01）。距癌组织远端10cm组织中DNA含量为正常组织，不同于癌组织，可视为安全范围。距癌远端2cm的癌旁组织中DNA含量接近癌组织，不同于正常组织，可视为不安全范围。与细胞学病理检查一致。

本研究表明，直肠癌细胞中DNA倍体异常与肿瘤大体形态无关。隆起型、溃疡型、浸润型直肠癌组织的异倍体率分别为92.86%、92.11%、87.50%，无显著统计学差异。DNA倍体异常与肿瘤浸润深度有关。浸润到黏膜层、肌层、浆膜层的直肠癌组织异倍体率分别为0%、50.0%、87.5%，差别存在显著统计学意义。有淋巴结转移和无淋巴结转移的DNA倍体异常率分别为100%和86.48%，两组有显著性差异。说明伴有淋巴结转移的直肠癌组织其异倍体率较高。因此DNA异倍体能反映肿瘤的生物学特性，对于评估直肠癌的目前的状况和预后判断有一定的价值，值得进一步深入研究。

3.3 DNA异倍体能反映肿瘤的生物学特性，同时它往往出现在组织病理学改变之前，可作为诊断细胞早期癌变的辅助指标。细胞遗传学与DNA异倍体相关性研究表明，DNA异倍体的细胞往往伴有遗传学的异常改变，提示DNA异倍体可能是细胞染色体发生了某些不稳定性改变（如癌基因突变）的结果，且这些不稳定性改变积累到一定程度，出现优势细胞克隆时，癌的发生将是不可避免的。因此，在组织学未见到癌变征象时，DNA异倍体可作为监视细胞癌变的一个有益的补充，将能更好的预示细胞的恶性转化，有助于发现难以确定的“生物学”早期癌组织。故DNA异倍体能反映肿瘤的生物学特性，同时它往往出现在组织病理学改变之前，可作为诊断细胞早期癌变的辅助指标。DNA异倍体测定作为一项简便易行的，灵敏度相对较高的直肠癌诊断方法，在直肠癌的筛查过程中，有可能起到更重要的作用。

［1］Lengauer C，Kinzler KW，Vogelstein B.Genetic instability in colorectal cancers［J］.Nature，1997，386：623-627.

［2］Miyazaki M，Furuya T，Shiraki A，et al.The relationship of DNA ploidy to chromosomal instability in primary human colorectal cancers［J］.Cancer Res，1999，59：5283-5285.

［3］Yao J，Eu KW，Seow-Choen F，et al.Microsatellite instability and aneuploidy rate in young colorectalcancer patients do not differ significantly from those in older patient［J］.Int J Cancer，1999，80：667-670.

［4］Ionov Y，Peinado MA，Melkhosyan S，et al.Ubiquitous somatic mutations in simple repeated sequences reveal a new mechanism for colonic carcinogenesis［J］.Nature，1993，363：558-561.

［5］Thibodeau SN，Bren G，Schaid D.Microsatellite instability in cancer of the proximal colon［J］.Science，1993，260：816-819.

［6］Konemann S，Schuck A，Malath J，et al.Willich N.Cell heterogeneity and subpopulations in solid tumors characterized by simultaneous immunophenotyping and DNA content analysis［J］.Cytometry，2000，41（3）：172-177.