桔梗总皂苷对人肺腺癌细胞系A549移植裸鼠瘤生长和STAT2的影响

易亚乔 ，葛金文 ，伍参荣 ，喻 嵘 ，田雪飞 ，陈 懿 ，邓玺玮 ，彭国璇

（1.湖南中医药大学仲景学说教研室，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学中西医结合基础重点学科，湖南 长沙 410208；3.湖南中医药大学临床医学院，湖南 长沙 410208）

桔梗总皂苷对人肺腺癌细胞系A549移植裸鼠瘤生长和STAT2的影响

易亚乔1，葛金文2，伍参荣2，喻 嵘1，田雪飞2，陈 懿2，邓玺玮3，彭国璇3

（1.湖南中医药大学仲景学说教研室，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学中西医结合基础重点学科，湖南 长沙 410208；3.湖南中医药大学临床医学院，湖南 长沙 410208）

目的 探讨桔梗总皂苷体内抑制人肺腺癌细胞系A549裸鼠移植瘤生长及其对肿瘤细胞信号传导与转录激活因子2（signal transducer and activatorot transcription2，STAT2）的影响。方法 将荷人A549移植瘤BALB/c裸小鼠随机分为模型组、环磷酰胺组、桔梗总皂苷组 1（5 mg/kg·d）、桔梗总皂苷组2（10 mg/kg·d）、桔梗总皂苷组 3（20 mg/kg·d）、桔梗总皂苷组4（25 mg/kg·d），分别治疗观察30 d，测量瘤体积与质量，并用HE染色观察各组移植瘤组织的病理形态结构，用免疫组化法检测瘤体细胞STAT2蛋白的表达。结果 模型组与桔梗总皂苷各组对人肺癌细胞系A549移植瘤抑制作用比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；桔梗总皂苷对移植瘤体积与抑瘤率均显示出较好作用，桔梗总皂苷组4移植瘤的体积明显小于模型组、桔梗总皂苷其它各组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；桔梗总皂苷各组移植瘤体积大于环磷酰胺组，差异有统计学意义（P＜0.05）；桔梗总皂苷各组STAT2表达由强到弱随浓度的增加而减弱，成剂量依赖关系，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。结论 桔梗总皂苷对A549肺移植瘤组织生长有较好抑制作用，可能通过下调移植瘤组织STAT2蛋白表达来抑制瘤组织的生长。

桔梗总皂苷；人肺腺癌细胞系A549细胞；移植瘤；细胞信号传导及转录激活因子2；裸鼠

目前国内外对细胞信号传导及转录激活因子家族在肺癌方面的研究主要集中在细胞信号传导及转录激活因子 3 （signal transducer and activatorot transcription3，STAT3），而细胞信号传导及转录激活因子2（signal transducer and activatorot transcription2，STAT2）在肺癌组织中的表达，至今国内外相关研究极少。前期体外研究发现桔梗总皂苷对A549肺癌细胞的增殖有明显的抑制作用[1]，为进一步探讨其体内作用机制，本实验采用免疫组化法检测裸小鼠肺移植廇STAT2的表达，探讨STAT2与肺癌发生及发展的关系，旨在研究桔梗总皂苷抑制人肺腺癌细胞系A549裸小鼠移植瘤生长的作用机制，为中医药有效防治肺癌提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 BALB/c 6～8周龄裸小鼠，SPF级，体质量（20±2）g，雄性，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物合格证号：SCXK（湘）2009-2004。

1.1.2 药物 环磷酰胺口服片（南通精华制药有限公司，规格：50 mg/片，批号：010052803）；由湖南省中医研究院中药超微中心提供47 g桔梗总皂苷粉，4℃保存，供试验用。实验时用细胞培养液稀释成1 mg/mL。阳性对照药：环磷酰胺（江苏恒瑞医药股份有限公司产品，批号20110921203）。

1.1.3 试剂 STAT2 96T上海研鑫生物科技有限公司购入，美国GBD产品。

1.1.4 细胞 人肺腺癌细胞株A549购于中南大学湘雅医学院现代实验细胞库。

1.1.5 仪器 酶标仪MK3(LABSYS TEMS公司)；HeraeusBB15细胞培养箱、Thermo702低温冰箱、Thermo Scientific Holten超净工作台 (Thermo Scientific Forma 公司)；显微镜 Motic-BA400（Olympus公司，日本）；TGL-20M/TGL-20MC低温离心机(长沙平凡仪器仪表公司)等。

1.2 方法

1.2.1 造模 实验方法[2]以含有10%新生牛血清RPMI 1640培养基中，37℃ A549肺癌细胞、5%CO2的培养箱中培养，细胞贴壁，长满细胞单层，用0.25%胰酶和 0.02%二胺四乙酸（EDTA）（1∶1）消化传代。将处于对数生长期的A549肺癌细胞，常规胰酶消化、洗涤、计数后，以PBS调整细胞浓度为5×106/mL，用一次性无菌注射器将A549肿瘤细胞移植于裸鼠前肢腋下皮下，每只裸鼠注射0.2 mL，常规饲养、观测裸鼠成瘤的时间、成瘤率。待裸鼠瘤体生长至直径约5 mm时，开始药物干预。

1.2.2 分组与给药 采用随机数字表随机分为模型组，环磷酰胺组（10 mg/kg·d），桔梗总皂苷组 1、2、3、4（依次给予桔梗总皂苷 5、10、20、25 mg/kg·d）。每只裸鼠每天经口灌胃给药1次，每次0.4 mL（给药剂量按成人与大鼠间每公斤体质量占体表面积比值算得)；模型组给予相同体积生理盐水。

1.3 指标评价

1.3.1 裸鼠移植瘤体积、质量测定 各裸鼠从用药第 10、15、20、25、30 天分别测量肿瘤的大小，用游标卡尺测量肿瘤的最长径及最宽径。根据公式计算移植瘤体积V(mm3)=(最长径×短径2)/2。

1.3.2 裸鼠移植瘤抑制率计算 用药30 d后处死动物，称瘤质量，计算抑瘤率。 抑瘤率=（1-ET／EC）×100%（EC为对照组平均瘤质量，ET为治疗组平均瘤质量）。

1.3.3 病理形态学观察 待动物处死后，取各组裸鼠移植瘤送病理切片，HE染色观察病理结果。

1.3.4 裸鼠移植瘤STAT2蛋白表达的检测 取移植瘤组织标本石蜡包埋，切片，将STAT2抗体1∶100稀释后，用免疫共沉淀试剂盒（Streptavidin-biotin immuno-perxidase complex kit），按照试剂盒操作说明检测STAT2，阴性对照以封闭血清代替STAT2，其他操作步骤相同。苏木素复染，光学显微镜下观察，采用Motic Med 9.0数码医学图像分析系统采集并记录光密度值（每张切片随机采集5个视野，测定每个视野下染色阳性区的平均光密度和面积），计算阳性区积分光密度，取其平均值用阳性区平均积分光密度值来表示STAT2免疫组化染色阳性的表达程度，积分光密度值越大，表示STAT2免疫组化染色阳性的表达程度越高。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 人肺癌A549细胞移植裸鼠成瘤率

A549细胞裸鼠移植术后2～3 d明显可见质软结节，随后肿瘤不断增大。平均成瘤时间为（5±2）d。60只裸鼠全部成瘤，成瘤率为100%。

2.1.1 不同时间各组裸鼠移植瘤体积的比较 对人肺癌细胞系A549移植癌的抑制作用，用药15 d后，桔梗总皂苷各组与模型组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；不同剂量的桔梗总皂苷对A459移植瘤的抑制作用差异有统计学意义（P＜0.05），药物对裸鼠移植瘤的抑制作用亦随剂量的增加，抑制作用逐渐增强。桔梗总皂苷组4裸鼠移植瘤的体积明显小于模型组，用药20 d后，与桔梗总皂苷1、2、3组比较差别均有统计学意义（P＜0.05）；桔梗总皂苷各组移植瘤体积大于环磷酰胺组，差异有统计学意义（P＜0.05）。 结果见表 1～2。

2.1.2 各组裸鼠移植瘤体质量与抑瘤率比较 桔梗总皂苷各组与模型组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）；不同剂量的桔梗总皂苷对A549移植瘤体质量与抑制率差别有统计学意义（P＜0.05），其抑制作用亦随剂量的增加逐渐增强，结果分析与上述对肿瘤体积影响基本一致。见表2。

2.2 桔梗总皂苷对裸鼠移植瘤组织病理形态的影响

模型组瘤细胞体积大且大小不均，呈弥漫性分布，细胞圆形多角形，排列呈巢状、团块或条索状；核浆比例大，胞核深染，核分裂相多见；而环磷酰胺组、桔梗总皂苷各组瘤细胞体积较模型组、桔梗总皂苷各组减小，核浆比例明显缩小，胞核染色较浅，核分裂相显著减少，环磷酰胺组瘤体组织病理改善明显优于桔梗总皂苷各组，结果见图1。

2.3 桔梗总皂苷对裸鼠移植瘤STAT2表达的影响

模型组瘤细胞STAT2表达明显高于环磷酰胺组、桔梗总皂苷各组，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。环磷酰胺组STAT2表达明显低于桔梗总皂苷组 1、2、3、4，差异均有统计学意义(P＜0.05）。 桔梗总皂苷各组STAT2表达由强到弱，成剂量依赖关系。结果见表3。

表1 不同时间各组裸鼠移植瘤体积的比较 （，mm3，n=10）

表1 不同时间各组裸鼠移植瘤体积的比较 （，mm3，n=10）

注：与模型组比较*P＜0.05；与环磷酰胺组比较△P＜0.05；与桔梗总皂苷组1比较＃P＜0.05；与桔梗总皂苷组2比较◇P＜0.05；与桔梗总皂苷组3比较▲P＜0.05；与桔梗总皂苷组4比较☆P＜0.05。表2同。

组 别模型组环磷酰胺组桔梗总皂苷组1桔梗总皂苷组2桔梗总皂苷组3桔梗总皂苷组4给药量 mg/（kg·d）生理盐水10 5 10 20 25 10 d 83.14±21.25 58.19±20.11*82.14±20.51△82.67±20.21△82.15±19.46△81.28±20.27△15 d 126.20±31.27 46.73±16.14*107.15±26.17*△◇▲☆98.27±30.21*△＃▲☆88.53±20.14*△◇79.72±22.01*△◇▲20 d 260.10±41.00 32.45±13.16*◇132.14±39.03*△◇▲☆101.10±41.00*△＃▲☆88.25±21.03*△◇☆74.14±30.26*△#◇▲25 d 367.11±55.05 20.14±4.16*◇227.11±38.05*△◇▲☆117.11±34.05*△＃▲☆85.11±30.11*△◇☆67.38±28.33*△#◇▲30 d 478.16±50.25 14.32±1.17*◇258.16±40.15*△◇▲☆128.16±32.30*△＃▲☆84.06±26.09*△◇☆58.10±20.30*△#◇▲

表2 各组裸鼠移植瘤给药30 d后体质量和抑瘤率的比较（，n=10）

表2 各组裸鼠移植瘤给药30 d后体质量和抑瘤率的比较（，n=10）

组 别模型组环磷酰胺组桔梗总皂苷组1桔梗总皂苷组2桔梗总皂苷组3桔梗总皂苷组4给药量 mg/（kg·d）生理盐水10 5 10 20 25体质量（g）5.01±1.21 1.21±0.32*＃◇▲☆3.68±1.18*△◇▲☆3.06±0.53*△＃▲☆2.64±0.51*△＃◇☆2.19±0.49*△＃◇▲抑瘤率（%）0 76.26±2.64*＃▲☆28.02±3.15*△◇▲☆39.21±4.65*△＃▲☆47.25±3.29*△＃◇☆57.42±3.85*△＃◇▲

图1 各组裸鼠移植瘤形态病理显微观察图（HE染色×200）

表3 各组裸鼠移植瘤STAT2光密度值测定结果比较（，n=10）

表3 各组裸鼠移植瘤STAT2光密度值测定结果比较（，n=10）

注：与模型组比较*P＜0.05；与环磷酰胺组比较△P＜0.05；与桔梗总皂苷组1比较＃P＜0.05；与桔梗总皂苷组2比较◇P＜0.05；与桔梗总皂苷组3比较▲P＜0.05。

组 别模型组环磷酰胺组桔梗总皂苷组1桔梗总皂苷组2桔梗总皂苷组3桔梗总皂苷组4给药量 mg/（kg·d）生理盐水10 5 10 20 25 STAT2（OD）66.78±12.146 6.12±2.32*＃◇▲50.68±10.13*△▲46.25±9.53*△▲30.17±8.59*△＃◇20.36±8.49*△＃◇▲

模型组瘤细胞中STAT2蛋白表达较多，光镜可见棕黄色颗粒明显，呈强阳性表达；而桔梗总皂苷各组棕黄色颗粒较少，呈弱阳性表达；环磷酸酰胺STAT2蛋白几乎无表达。因为STAT2蛋白异常激活将导致细胞的异常增殖和凋亡障碍，促进肿瘤的发生、发展，相比模型组，桔梗总皂苷各组明显下调STAT2蛋白的表达，且不同浓度的桔梗总皂苷对下调STAT2蛋白的作用有差异，结果见图2。

图2 各组裸鼠移植瘤肿块STAT2表达的光镜图（免疫组化染色×400）

3 讨论

肺癌为全世界发病率最高的恶性肿瘤之一[3]，中医药在内的多学科综合治疗及其机制研究已成为肺癌防治研究的热点[4-5]。目前对于肿瘤发生机制的研究主要集中在肿瘤相关基因的克隆、细胞信号传导通路以及细胞周期调控三大领域。其中，细胞信号传导通路中的关键点—信号传导与转录激活因子(signal transducers and activators of transcription，STATs)成为近年来研究的热点。研究认为：STAT家族是具有高度同源性的转录因子，可介导多种细胞因子和生长因子的信号向细胞核内转导，影响靶基因的转录，从而调节细胞功能，与肿瘤发生、发展和凋亡有密切关系。通过参与对调控细胞凋亡的细胞因子，蛋白激酶和抗凋亡基因表达的调节，对抗细胞凋亡，参与肿瘤的发生。STATs主要参与介导细胞因子和生长因子对细胞的信号转导作用，调控靶基因的表达，进而影响着细胞的增殖、分化、衰老和凋亡，对肿瘤的发生和发展有重要作用[6]；STATs异常激活将导致细胞的异常增殖和凋亡障碍，促进肿瘤的发生、发展[7]；STAT2基因在肿瘤发展中呈现高表达[8]，即STAT2蛋白表达上调，肿瘤的发展越明显。反之，表达减少，则可说明干预作用越好。

桔梗具有化痰止咳、排脓消痈的功效，临床常用于肺系疾病（上呼吸道感染、肺脓肿、肺癌等）的治疗[9]，前期通过体外实验证实桔梗总皂苷对肺癌细胞A549的生长有抑制及诱导凋亡作用。该研究表明桔梗总皂苷对移植瘤体积与抑瘤率均显示出较好的抑制作用，桔梗总皂苷对裸鼠机体移植瘤的抑制作用及抑瘤率亦随剂量的增加抑制作用逐渐增强；对裸鼠移植瘤组织病理形态学的改变是瘤细胞体积较模型组减小，核浆比例明显缩小，胞核染色较浅，核分裂相显著减少，环磷酰胺组瘤体组织病理改善虽明显优于桔梗总皂苷各组，但存在一定的药物副作用，在抑瘤的同时会出现较多的不良反应。相对桔梗总皂苷，对肿瘤的发生发展有着很好的抑制作用，副作用不明显、桔梗总皂苷在免疫调节的特异性免疫应答和非特异性免疫应答两方面均有显著的药理活性，在这方面明显优于环磷酰胺[10]。采用免疫组化法观察移植瘤模型组瘤组织细胞STAT2蛋白表达明显高于环磷酰胺组、桔梗总皂苷各组，提示STAT2确实参与肿瘤的发生发展；桔梗总皂苷能降低移植瘤组织STAT2蛋白表达，同时也证明桔梗总皂苷有对A549肺移植瘤有较好抑制作用，桔梗单味中药可联合其它中药和中药提取的有效成分共同且多靶点治疗肿瘤（如黄芪、紫杉醇），为临床肿瘤药理研究提供进一步思路，值得进一步探讨。

[1]易亚乔，伍参荣，葛金文，等.桔梗总皂苷对人肺腺癌A549细胞抑制作用研究[J]. 中华中医药杂志，2013，28（7）：30-33.

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[4]屠洪斌.益气养阴方减轻肺癌放射治疗毒副反应疗效观察[J].湖南中医药大学学报，2013，33(5)：86-89.

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[9]徐国华，陆小松，戴小军.桔梗在呼吸系统疾病中的应用近况[J].现代中西医结合杂志，2001，10(20)：2 016-2 016.

[10]尹若熙，俞腾飞，李中燕，等.桔梗的药理学研究进展[J].中国医药科学，2012，2(19)：36-37.

（本文编辑 徐爱良）

Effects of total platycodins on the growth of transplantation tumor of human lung adenocarcinoma A549 and STAT2 expression in nude mice

YI Yaqiao1,GE Jinwen2,WU Canrong2,YU Rong1,TIAN Xuefei2,CHEN Yi2,DENG Xiwei3,PENG Guoxuan3
(1.Teaching and research office of Zhongjing Theory,Hunan University of CM,Changsha,Hunan 410208,China;2.Key discipline of Integrated Chinese and Western medicine,Hunan University of CM,Changsha,Hunan 410208,China;3.College of Clinical Medicine,Hunan University of CM,Changsha,Hunan 410208,China)

Objective To investigate the inhibition effects of total platycodins on thetransplantation tumor growth of human lung adenocarcinoma cell line A549 and STAT2 expression in nude mice.Methods The BALB/c nude mice bearing human A549 lung cancer were randomly divided into modelgroup,cyclophosphamide group,platycodins group 1(5 mg/kg·d),platycodinsgroup 2(10 mg/kg·d),platycodinsgroup 3(20 mg/kg·d)and platycodins group 4(25 mg/kg·d).They were treated and observed for 30 days,and tumor volume and tumor mass were tested,morphology and the tumor tissues were observed by H-E staining,STAT2 expression was detected by immunohis to chemistry. Results There were significant differences between model group and each total platycodins group in the growth of the transplantation tumor of human lung adenocarcinoma cell line A549 in nude mice(P＜0.05).There were better inhibition effects on transplantation tumor sizes and tumor inhibition rates in all total platycodins groups.The transplantation tumor sizes in platycodins group 4 was significantly lower than those of model group and other platycodins groups(P＜0.05);transplantation tumor sizes in all total platycodins groups were greater than that of cyclophosphamide group(P＜0.05);STAT2 expression in platycodins groups were reduced gradually with the increasing of total platycodins(P＜0.05)and showed concentration-dependent effects.Conclusion Platycodins have good inhibition effects on A549 lung tumor,which maybe related with the down-regulation of STAT2 expression.

Total platycodins;human lung adenocarcinoma A549 cell;transplantation tumor;cell signal transducer and transcription activator 2;nude mice

R285.5；R734.2

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2014.03.003.007.05

2013－11－22

国家自然科学基金资助项目（30801496）；湖南省科技厅资助项目（2013TT2025）;湖南省教育厅科研基金重点项目（10A089）；湖南省教育厅青年基金资助项目（13B083）。

易亚乔，女，硕士，讲师，主要从事肿瘤及心脑血管疾病中西结合防治研究。