丹龙醒脑方对局灶性脑缺血大鼠CA1区Nestin和GFAP表达的影响

韦琛静 ，周小青 *，刘旺华 ，李 花 ，谢梦洲 ，张利美 ，李路迢

（1.湖南中医药大学中医诊断研究所，湖南 长沙 410007；2.湖南中医药大学中医学院，湖南 长沙 410208）

丹龙醒脑方对局灶性脑缺血大鼠CA1区Nestin和GFAP表达的影响

韦琛静1，周小青1*，刘旺华1，李 花2，谢梦洲1，张利美1，李路迢1

（1.湖南中医药大学中医诊断研究所，湖南 长沙 410007；2.湖南中医药大学中医学院，湖南 长沙 410208）

目的 探讨丹龙醒脑方对大鼠脑缺血损伤后海马CA1区巢蛋白（Nestin）和胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）表达的影响。 方法 将48只大鼠随机分为假手术组、模型组、依达拉奉组、丹龙醒脑方组。采用大脑中动脉线栓法制备大脑中动脉闭塞再灌注(MCAO)模型，对大鼠进行神经功能缺损评分，采用HE染色观察海马CA1区细胞的形态学改变，采用免疫组化法检测海马CA1区Nestin蛋白和GFAP蛋白的表达。结果 与假手术组比较，模型组治疗3 d后和7 d后的神经功能缺损评分明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，依达拉奉组和丹龙醒脑方组治疗3 d后和7 d后的神经功能缺损评分明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)；丹龙醒脑方组在治疗3 d和7 d后Nestin蛋白的平均光密度增加(P<0.05)，GFAP蛋白的平均灰度值减少(P<0.05)。结论 丹龙醒脑方对海马CA1区病理形态有保护作用。丹龙醒脑方抗脑缺血损伤可能与促进海马区神经细胞增殖和分化有关。

脑缺血再灌注；丹龙醒脑方；巢蛋白；胶质纤维酸性蛋白；海马CA1区

缺血性脑血管病严重危害着人类的健康和患者的生活质量，其死亡率和致残率均居高不下。缺血性脑损伤后可促使神经细胞增殖、迁移和分化，而分化的新生神经元能部分替代和修复受损神经元，在一定程度上能改善神经功能缺损，参与神经再生和脑组织功能的恢复[1]。巢蛋白（Nestin）是神经干细胞所表达的一种特异性标志物，Nestin蛋白的表达水平可以作为神经干细胞发生的敏感性标志之一[2]。在中枢神经系统中，胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)是星形胶质细胞特异性活化的标志蛋白[3],而星形胶质细胞是保持神经元微环境稳态的重要细胞。以往的研究表明丹龙醒脑方可增加血脑屏障的通透性，能减轻脑缺血再灌注后海马CA1区损伤[4]。但是否是通过促进CA1区Nestin蛋白和GFAP蛋白表达促进神经再生，值得进一步研究。

1 材料和方法

1.1 药物

丹龙醒脑方由丹参15 g，三七12 g，地龙6 g，石菖蒲 12 g，远志 15 g，菟丝子 12 g，淫羊藿 10 g等组成。饮片购自湖南中医药大学第一附属医院。依达拉奉注射液（国瑞药业有限公司，批号：02-131102），规格 20 mL∶30 mg。 丹龙醒脑方饮片浸泡30 min，加水煎2次。头煎加6倍水，沸后文火慢煎40～60 min；二煎加4倍水，沸后文火慢煎 30～40 min，合并2次煎液，滤过，水浴浓缩为含生药1.0 g/mL，灭菌分装，4℃ 冰箱冷藏。

1.2 主要试剂和仪器

多聚甲醛（批号：P1010）、Nestin兔抗大鼠抗体（批号：BA1289）、GFAP兔抗大鼠抗体（批号：BA0056）、二抗为山羊抗兔 IgG（批号：K136907E），均为北京中杉金桥生产；辣根酶标记、DAB显色剂，均购自武汉博士德生物有限公司。AO-820切片机（产地美国）；DNP-9162型恒温培养箱（上海精宏医疗仪器厂）；光学显微镜(Motic国产)以及病理图像分析软件系统。

1.3 动物分组及给药

清洁级SD大鼠48只,雄性，体质量200～250 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK(湘)2011-0003。随机分为2组，即假手术组（12只），实验组（36只），实验组用大脑中动脉栓塞再灌注法（大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO）造模后，随机分为模型组（12 只）、依达拉奉组（12只）、丹龙醒脑方组（12只）。假手术组除不插线外，余操作过程同MCAO。从手术后24 h开始给药，剂量以70 kg成人为标准按体表面积换算，丹龙醒脑方组剂量为7.4 g/kg，灌胃给药；依达拉奉组剂量为3.2 mg/kg，腹腔注射。假手术组、模型组给予等体积蒸馏水灌胃。以上各组每天灌胃1次，连续7 d。

1.4 动物模型制备和评估

根据改良Longa等[5]的方法，建立MCAO再灌注模型，缺血2 h,再灌注3、7 d。 参照Zea-Longa评分标准进行神经功能症状计分[5]：在大鼠术后24 h内进行评分：0分，无神经损伤症状；1分，不能完全伸展对侧前爪；2分，向对侧转圈；3分，向对侧倾倒；4分，不能自发行走，意识丧失。神经功能缺损程度评分为1～3分的大鼠即为成功模型。

1.5 样本采集与处理

给药第3天和第7天给药后4 h分两次处死动物，每个时间点6只，在两个相应的时间位点前，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，然后打开胸腔，在右心耳部剪一小口，从左心室插入导管至主动脉，向内迅速注入肝素化生理盐水约200 mL。当右心耳流出液变清亮后，注入的多聚甲醛磷酸盐缓冲液约350 mL，灌流固定30 min后断头取脑，放入固定液中，脱水、透明、浸蜡。制作脑部冠状切片。

1.6 免疫组织化学

按试剂盒说明操作，采用免疫组化PV9000法。切片脱蜡至水，3%H2O2去离子水孵育10 min，PBS充分漂洗2 min×3次，滴加Nestin抗体、GFAP抗体，37℃孵育 2 h，PBS充分漂洗 2 min×3次，37℃孵育20 min，PBS充分漂洗2 min×3次，滴加辣根酶标记的山羊抗兔IgG，37℃孵育20 min，PBS充分漂洗2 min×3次，DAB显色液室温下显色，蒸馏水冲洗，复染、脱水、透明、封片。用PBS代替Nestin抗体、GFAP抗体作阴性对照。在大鼠脑缺血CA1区同倍(×400)的6个不同视野，用病理图像分析软件系统分析统计每个视野下Nestin蛋白的平均光密度，GFAP蛋白的平均灰度值，分别取平均值。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 各组大鼠脑组海马CA1区神经细胞HE染色的比较

假手术组脑组织海马CA1区神经细胞层次分明，排列整齐，细胞核大而圆，胞浆染色均匀。模型组细胞数量减少，排列不齐，间隙增大，细胞核固缩浓染。依达拉奉组和丹龙醒脑方组比模型组细胞层次增多，仍可见少量细胞核固缩，胞浆染色变浅。见图1。

图1 脑组织海马CA1区病理形态光镜图（HE染色×400）

2.2 各组大鼠神经功能缺损评分比较

与假手术组比，模型组在第3天、第7天的神经功能缺损评分均明显升高(P<0.05)；与模型组比，丹龙醒脑方组与依达拉奉组在第3天、第7天的神经功能缺损评分显著降低(P<0.05)。详见表1。

表1 大鼠神经功能缺损评分比较 （，n=6，分）

表1 大鼠神经功能缺损评分比较 （，n=6，分）

注：与假手术组比较*P＜0.05；与模型组比较#P＜0.05。下表同。

组别 剂量3 d 7 d假手术组模型组依达拉奉组丹龙醒脑方组- -0 0 3.2 mg/kg 7.4 g/kg 2.75±0.13*2.55±0.12*#2.23±0.06*#2.44±0.12*2.16±0.10*#1.80±0.07*#

2.3 各组大鼠Nestin蛋白表达平均光密度值比较

与假手术组比较，治疗3 d和7 d后其余各组Nestin的平均光密度值均增加，即阳性表达增加(P＜0.05)；与模型组比较，治疗3 d和7 d后依达拉奉组和丹龙醒脑方组Nestin的平均光密度值均增加，即阳性表达增加(P＜0.05)。结果见表2。

表2 大鼠CA1区Nestin平均光密度值的比较 （，n=6）

表2 大鼠CA1区Nestin平均光密度值的比较 （，n=6）

组别假手术组模型组依达拉奉组丹龙醒脑方组剂量- -3.2 mg/kg 7.4 g/kg 3 d 0.098±0.017 0.168±0.015*0.220±0.018*#0.228±0.017*#7 d 0.108±0.019 0.186±0.025*0.251±0.034*#0.256±0.030*#

2.4 各组大鼠GFAP蛋白的平均灰度值比较

与假手术组比较，治疗3 d和7 d后其余各组GFAP蛋白的平均灰度值均减少，即阳性表达增加(P＜0.05)；与模型组比较，治疗3 d和7 d后依达拉奉组和丹龙醒脑方组的GFAP蛋白的平均灰度值减少，即阳性表达增加(P＜0.05)。结果见表3。

表3 大鼠CA1区GFAP平均灰度值表达量的比较（，n=6）

表3 大鼠CA1区GFAP平均灰度值表达量的比较（，n=6）

组别假手术组模型组依达拉奉组丹龙醒脑方组剂量- -3.2 mg/kg 7.4 g/kg 3 d 177±8.84 153±10.91*131±17.58*#122±13.97*#7 d 174±9.54 143±11.03*124±12.88*#117±10.65*#

3 讨论

缺血性脑血管病其死亡率和致残率一直居高不下，所造成的神经功能缺失为研究的难点，中枢神经系统神经元可再生被发现后，脑缺血后神经干细胞的增殖、分化方面的研究成为当前神经科学领域研究的热点。研究表明，哺乳动物中枢神经系统有产生新神经元和修复受损区的能力，中枢神经系统具有的这种能力与脑内的神经干细胞是分不开的。正常情况下,神经干细胞以静止、不增殖状态而存在。脑缺血时在海马齿状回及侧脑室室管膜下区等处存在具有多向分化潜能的神经干细胞[6]。神经干细胞开始增多，表明与神经细胞的修复有关[7]。

Nestin是神经干细胞所表达的一种特异性标志物，在神经系统发育的过程中，作为神经干细胞的标记蛋白参与神经再生和促进脑组织功能的恢复[8]。Nestin的表达水平具有特异性和阶段性，在病理情况下，受损脑组织神经上皮干细胞蛋白的Nestin表达水平，可以作为神经干细胞发生水平的敏感性标志之一[9]。 有研究证明脑缺血后Nestin表达呈单峰变化趋势，从1 d时开始增加，7 d达一小高峰[10]。本实验大鼠脑缺血3 d和7 d后，脑组织CA1可见到Nestin蛋白阳性细胞的表达，与文献报道[11]一致。

GFAP是星形胶质细胞特异性活化的标志蛋白。活化的星形胶质细胞对于保持神经元微环境的稳定及神经元的正常功能具有重要意义，是保持神经元微环境稳态的重要细胞，能改变神经元微环境并对其进行调节[3]。胶质细胞不仅给神经元提供营养代谢的支持，而且在脑缺血等神经系统疾病的发病过程中起着至关重要的作用[12]。研究表明，脑缺血后,GFAP表达在缺血侧皮质，纹状体，海马区域有表达升高[8]。胡氏[13]研究表明，益气活血方能促进脑缺血后GFAP表达升高，能促进脑缺血后神经细胞轴突的再生,促进脑卒中后神经功能的恢复。本实验脑缺血再灌注海马CA1区中枢神经系统损伤时，GFAP表达呈现上调趋势，从缺血后3 d开始，GFAP增多，第7天达到峰值，与以往研究[14-15]相似。

丹龙醒脑方以丹参为君，辅以三七、远志、石菖蒲为臣，以地龙、淫羊藿、菟丝子为佐使。丹参、三七、地龙三者配伍，可以活血化瘀，通利经络，相辅相成，相得益彰，使其活血通络之力加倍。瘀阻脑络，气机不利，津停液阻，化浊为痰，痰由瘀生，痰瘀互结，配伍远志、石菖蒲，得以化痰开窍。配伍淫羊藿、菟丝子，得以温阳化气，并推动血行，助血脉流通，表明丹龙醒脑方能促进海马CA1区Nestin蛋白和GFAP蛋白的表达，可能通过促进神经干细胞增殖、分化，促进神经再生，改善神经功能。现代药理学研究表明,丹参酮ⅡA[16]能提高脑组织的抗氧化能力，减轻大脑神经元的损伤；地龙[17]能够提高脑缺血再灌注脑组织酶的活性，有效降低各种自由基、炎性细胞因子水平，发挥着抗炎、抗损伤作用；三七总皂苷[18]能促进脑缺血大鼠脑组织GFAP的表达增加。这可能是丹龙醒脑方促进神经干细胞增殖、分化的物质基础，其具体机制有待进一步研究。

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（本文编辑 杨 瑛）

Effects of Expression of Danlongxingnao Recipe on Nestin Protein and GFAP Protein in Rats CA1 Area after Focal Cerebral Ischemia

WEI Chenjing1,ZHOU Xiaoqing1*,LIU Wanghua1,LI Hua2,XIE Mengzhou1,ZHANG Limei1,LI Lutiao1.
（1 Research Institute for Diagnostics of Traditional Chinese Medicine,Hunan University of Chinese Medcine，Changsha,Hunan 410007,China;2 School of Traditional Chinese Medicine,HUCM,Changsha,Hunan 410208,China）

Objective Explore the influence of Danlongxingnao recipe on expression of Nest in protein and GFAP protein in rats CA1 area after focal cerebral is chemia/reperfusion.Methods The 48 rats were randomly divided into sham-operation group,modelling group,Danlongxingnao recipe group and edaravone group.The modle of cerebral is chemia reperfusion（I/R）was induced by middle cerebral artery occlusion(MCAO)and recanalization.Neurological symptom score wereevaluated.HE staining of the cells was used to observe the morphology changes in hippocampus CA1 area.Nestin protein and GFAP Protein were observed by immunohistochemical method in CA1 area.Results Compared with sham-operation,neurological symptom score of model group were increased and the result was significant(P＜0.05)after 3d and 7d treatment.Compared with modelgroup,neurologicalsymptom score ofDanlongxingnao recipe group and edaravone group were decreased and the result was significant(P＜0.05)after 3d and 7d treatment.The expression of average optital density of Nestin protein in Danlongxingnao recipe increased after 3d and 7d treatment(P＜0.05)and the expressions of average gradation of GFAP protein in Danlongxingnao recipe decreased after 3d and 7d treatment(P＜0.05).Conclusion The Danlongxingnao recipe had protective effects on the pathological morphological changing in hippocampus CA1 area.Danlongxingnao recipe can make effects after focal cerebral ischemia/reperfusion and it may be associated with promoting the proliferation and differentiation of neural stem cells.

Focal cerebral is chemia/reperfusion； danlongxingnao recipe； Nestin； glial fibrillary acidic protein； hippocampus CA1 area；

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2014.05.003.009.05

2014－03－24

国家自然科学基金资助项目（81202632，81373702），教育部博士点基金资助项目（20124323120003），湖南省科技厅重点项目资助（2011FJ2013），湖南省自然科学基金资助（13JJ3097），湖南省教育厅科研项目资助（12B097）。

韦琛静，女，在读硕士研究生，主要从事中医诊断学研究。

* 周小青，男，教授，博士研究生导师，E-mail：zxq5381@sohu.com