地塞米松对体外培养足细胞nephrin磷酸化的影响

聂国明 邹敏书 余 健 罗莉漫 徐洪涛 毛娇娇

在肾小球选择性滤过过程中，肾小球滤过屏障阻止蛋白尿的滤出。滤过屏障由3层组成:内皮细胞、基膜(GBM)和足细胞，后者是阻止蛋白漏出最主要的细胞，足细胞合成nephrin，其位于足突裂孔隔膜区，是防止白蛋白滤出的关健及中心结构。Nephrin是肾小球裂孔隔膜上发现的第1个跨膜蛋白，是NPHS1的基因产物，此基因突变出现芬兰型肾病综合征，在维持足细胞正常功能过程中起至关重要的作用。Nephrin不仅是黏附分子，而且是信号转导分子，参与足细胞的信号转导［1］。Nephrin磷酸化被认为是维持正常足细胞形态和功能的起始事件，主要是指酪氨酸磷酸化，其胞内段含有9个酪氨酸残基，是潜在的磷酸化位点［2］。研究发现，nephrin的胞内段磷酸化与Src家庭激酶Fyn和适配蛋白Nck相关，Fyn是Src激酶，在Y1204位点磷酸化nephrin。Nck含有3个SH3区和1个SH2区，可结合到nephrin磷酸化位点Y1204，募集信号转导分子，诱导肌动蛋白聚合［3］。在Fyn和Nck敲除鼠，足细胞出现足突融合及蛋白尿，证实体内足细胞信号瀑布的重要性［4］。

糖皮质激素是治疗肾小球蛋白尿的主要药物。然而其对足细胞的精确作用机制尚不十分明确。阿霉素动物模型表现为足细胞足突融合、肌动蛋白重排、大量蛋白尿，而Dex可直接保护阿霉素诱导足细胞损伤，稳定α-辅肌动蛋白4的表达［5］。既往研究显示，Dex可维持肾小球nephrin的表达，减轻尿白蛋白的排泄，抑制肾小球上皮间制动转化［6］。本实验观察Dex对nephrin磷酸化的影响，探讨Fyn和Nck在nephrin磷酸化中的作用及Dex可能作用机制。

材料与方法

1．足细胞的培养:小鼠永生化足细胞株(MPC5)由美国Peter Mundel教授惠赠，细胞于含20U/ml γ-干扰素的1640培养液中，33℃、5%CO2培养。细胞传代后转入不含γ-干扰素培养液中，37℃培养使足细胞分化10～14天后使用。

2．地塞米松处理:实验分组方法如下:体外培养的足细胞给予不同浓度 Dex 处理(0、1、10、100nmol/L)24h，100nmol/L Dex处理足细胞不同时间(0、12、24、36h)，Dex(100nmol/L)与足细胞一起培养，分别加入糖皮质激素受体拮抗剂RU-486及盐皮质激素受体拮抗剂RU-26572。对照组加缓冲液培养。磷酸化nephrin用兔抗pY1228 nephrin抗体测定。兔抗pY1228 nephrin抗体、RU-486及RU-26572购自Sigma公司。

3．足细胞转染:将足细胞接种于25cm2的培养瓶中，当细胞融合度达到50%～60% 时进行转染。足细胞分成以下3组:(1)未转染组:未经任何处理的足细胞;(2)转染NcksiRNA组:100nmol/L Dex与足细胞孵育24h，加Nck-siRNA表达质粒pGenesil/siRNA-Nck培养24h;(3)转染Fyn-siRNA组:100nmol/L Dex与足细胞孵育24h，加Fyn-siRNA表达质粒 pGenesil/siRNA-Fyn培养24h。利用JetPRIMETM进行转染，转染方法参照JetPRIMETM转染试剂的说明书。简述如下:将细胞种在3孔板上，每孔约40×104，待分化成熟后，将质粒按3微克/孔，转染试剂 JetPRIMETM按9．6微克/孔稀释，并等体积混合，室温反应30min后加入含培养基的3孔板中，培养24h荧光显微镜观测其转染率。分别采用 Western blot法检测 nephrin磷酸化的表达率。JetPRIMETM为法国Polyplus公司产品。Nck-siRNA、Fyn-siRNA由广州锐博生物科技构建。

4．Western blot测定nephrin的磷酸化:RIPA裂解液裂解细胞，提取细胞总蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度，每组取50μg蛋白上样，电泳、转膜、封闭，分别加入一抗(兔抗pY1228 nephrin抗体)，4℃过夜。辣根过氧化物酶标记的二抗37℃孵育1h。利用 UVP化学荧光成像系统(ChemiDoc-ItTM600 Imaging System)进行化学发光显影，以β-actin作为内参校正。

5．统计学方法:采用 SPSS 13．0统计软件进行统计学处理，计量资料采用均数±标准差(±s)表示，多组比较用one-way ANOVA方差分析，以P＜0．05为差异有统计学意义。

结 果

1．Dex改变 nephrin的磷酸化:与对照组相比，10、100nmol/L Dex处理足细胞明显增加nephrin的磷酸化水平，差异具有统计学意义(P均＜0．05，图1)。100nmol/L Dex 与足细胞孵育 0、12、24、36h。与对照组相比，12h没有明显增加nephrin的磷酸化水平(P＞0．05)，而24、36h明显增加 nephrin的磷酸化(P 均＜0．05，图2)。

图1 不同Dex浓度与足细胞培养24h的pY1228nephrin的表达

图2 100nmol/L Dex浓度与足细胞培养不同时间pY1228 nephrin的表达

2．糖皮质激素受体拮抗剂(RU-486)对Dex诱导nephrin磷酸化水平的影响:Dex(100nmol/L)与足细胞培养24h明显诱导nephrin磷酸化，这种效应可被糖皮质激素受体拮抗剂RU-486(1μmol/L)所抑制，而不被1μmol/L盐皮质激素受体拮抗剂 RU-26752所抑制(图3)。与对照组相比，Dex明显增加nephrin的磷酸化水平(P＜0．05)，而RU-486明显抑制Dex诱导nephrin磷酸化效应(P＞0．05)，RU-486组较Dex组nephrin的磷酸化水平明显降低，差异具有统计学意义(P＜0．05)。与 Dex及 RU-26752组相比，RU-26752组nephrin磷酸化水平明显升高(P＜0．05)，但与Dex组相比，不影响Dex诱导nephrin磷酸化效应(P＞0．05，图3)。

图3 糖皮质激素受体拮抗剂(RU-486)和盐皮质激素受体拮抗剂(RU-26752)对Dex诱导nephrin磷酸化水平的影响

3．siRNA沉默Nck或Fyn对Dex诱导nephrin磷酸化的影响:100nmol/L Dex与足细胞一起培养，分别加特异性siRNA沉默Nck或Fyn，培养24h。Dex明显诱导nephrin磷酸化，特异性siRNA沉默Nck，可部分抑制Dex诱导nephrin磷酸化增加，与Dex组相比，Dex+Nck-siRNA组nephrin磷酸化水平下降22．2%(P＜0．05)。特异性siRNA沉默Fyn则完全抑制Dex诱导nephrin磷酸的化，特异性siRNA沉默Nck及Fyn，亦完全抑制Dex诱导nephrin磷酸化(图4)。

图4 siRNA沉默Nck及Fyn降低Dex诱导nephrin磷酸化

讨 论

nephrin是裂孔隔膜上的重要分子，相邻足细胞足突之间通过nephrin相互连接，形成拉链样结构，阻止白蛋白滤出，其不仅是一种黏附分子，而且具有信号转导功能。最近研究发现，nephrin磷酸化在维持其足细胞的生理功能上起重要作用［7］。nephrin胞内段可被Src家族激酶Fyn磷酸化，磷酸化后的nephrin能招募含SH2结构的蛋白分子(如Nck等)，并与之结合，进一步调节足细胞凋亡信号或骨架肌动蛋白重组等［8］。因此，足细胞nephrin磷酸化是维持正常肾小球滤过屏障的重要开关。

地塞米松是治疗原发性肾小球疾病的常见药物，但其减轻蛋白尿的机制尚不十分明确，其对nephrin磷酸化的调节作用知之甚少。有研究显示，在正常情况下体内nephrin在Y1204和Y1228位点磷酸化均表明，在嘌呤霉素肾病(PAN)和人类微小病变肾病时这两位点磷酸化相类似减少，在PAN肾病模型中，这种减少在大量蛋白尿之前出现［9］。因检测Y1228位点磷酸化较Y1204位点更敏感，故本研究应用抗Y1228抗体检测nephrin的磷酸化水平。本研究结果显示，Dex作用的12h未能使nephrin磷酸化明显增加，而在24、36h nephrin磷酸化增加。低浓度(0、1nmol/L)nephrin磷酸化不明显，而 10、100nmol/L Dex使nephrin磷酸化明显增加，提示糖皮质激素增加nephrin的磷酸化与其浓度及作用时间有关。本研究进一步表明，Dex诱导nephrin磷酸化增加可被糖皮质激素受体阻断剂RU-486所阻断，而不被盐皮质激素受体阻断剂RU-26752所阻断，表明Dex诱导nephrin磷酸化是通过与糖皮质激素受体结合的基因组作用方式实现，而不是通过非受体的非基因组作用方式来实现，与Ohashi等［10］报道相一致。

在对足细胞Nck或Fyn特异性敲除小鼠模型的研究中发现，足细胞失去正常的足突间连接结构，并出现大量蛋白尿［11，12］。磷酸化nephrin能通过与适配蛋白Nck结合，调节肌动蛋白微丝重组。本研究结果显示，siRNA抑制Nck或Fyn，前者可部分抑制Dex诱导nephrin磷酸化增加，后者完全抑制Dex诱导nephrin磷酸化，提示Fyn在nephrin磷酸化过程中的核心地位，而Nck可能参与调节nephrin磷酸化。与既往报道的在足细胞脂筏结构中，Nck的SH3区与Fyn结合激活Fyn，形成正反馈，Fyn活性增加导致毗邻的nephrin分子多个酪氨酸残基磷酸化相一致［13］。

综上所述，本研究结果提示Dex与其受体结合促进nephrin的磷酸化，对激素治疗肾小球性蛋白尿机制有了进一步理解，但控制nephrin磷酸化的最佳水平及药物对nephrin磷酸化的影响，将是未来需要进一步阐明的问题。

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