产角蛋白酶菌株D5培养条件的研究

花万里 石绘陆 俞春山 任 俊 李治斌

宁夏中卫山羊选育场，宁夏中卫755006

角蛋白以动物的毛发、羽毛、蹄等为主要形式存在于自然界中，一般情况下很难被降解，但作为角蛋白酶的专一性底物，可被其降解。微生物来源的角蛋白酶是目前酶领域研究的热点之一，这类酶在医药、饲料、肥料、皮革、食品、纺织、日化等工业生产及环境治理方面都有广阔的应用前景［1］。我国畜禽饲养与加工业规模很大，每年产生大量废弃家禽羽毛。家禽羽毛的蛋白含量很高，而且富含动物所需的多种必需氨基酸，但是家禽羽毛的角蛋白稳定性非常强，很难被胃肠道内的消化酶消化，所以没有得到有效的利用。家禽屠宰场废弃物的大量排放已经给生态环境带来严重的压力［2］；同时，我国饲用蛋白质资源不足。如能对羽毛等角蛋白类物质加以利用，既可以避免环境污染又可以弥补饲用蛋白资源的不足。近年来，出现了利用高温高压降解和酸碱水解工艺生产的羽毛粉饲料，生产过程产生的废水会对环境造成一定污染；同时，此种羽毛粉饲料价格比较高，而且其中的一些氨基酸（即蛋氨酸、赖氨酸和色氨酸）遭到破坏，不易消化，营养价值不高［3］。

利用微生物发酵的方法制备鸡羽毛蛋白粉具有上述工艺无法比拟的优势［4］。首先，微生物发酵法制备鸡羽毛蛋白粉工艺不需要高温高压，可减少能源的消耗；同时发酵过程只需要弱碱或中性环境，而且固体发酵模式可减少水资源的使用和污水的排放，这样就能减轻对环境造成的压力。这种工艺的另外一个优势在于羽毛粉或新鲜的羽毛被微生物菌体和角蛋白酶协同作用后，二硫键被还原［5］，角蛋白的结构发生了改变，羽毛蛋白变得易消化，且氨基酸不被破坏，最大程度地提高了鸡羽毛蛋白的营养价值［6－7］。

目前国内对角蛋白酶的研究处于筛选高产角蛋白酶菌株、对发酵菌株产酶条件的优化及酶蛋白的纯化和生化性质研究阶段，没有发现有关角蛋白酶的工业化生产及应用的报道。角蛋白酶酶活力的测定方法有多种，测定的底物不同，加之各文献的测定条件也不尽相同，因此，很难比较不同研究者的研究水平。在国外，目前以地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）PWD1生产角蛋白酶的发酵试验研究已达到了工业化生产规模，并获得了德国生物技术研究所（BRI）的生产许可，生产商品名为Versazyme的角蛋白酶商品，2006年开始投入市场［8－9］。本试验通过测定不同影响因素条件下角蛋白酶的酶活力，确定了产角蛋白酶菌株D5的最佳培养基和最适发酵条件。

1 材料与方法

1.1 菌种选择

取中卫市某养鸡场处土样，经过多次分离纯化，获得1株能高效降解羽毛角蛋白的细菌D5。

1.2 试验时间与地点

试验于2013年6月在宁夏中卫山羊选育场实验室和宁夏大学农学院实验室进行。

1.3 发酵培养基的配制

牛肉膏：0.50%；水解鸡羽毛粉：5.00%；磷酸氢二钾：0.05%；蛋白胨：0.50%；硫酸铵：0.05%；硫酸镁：0.01%；氯化锌：0.01%；pH 7.50。

1.4 氮源对D5产蛋白酶影响的测定

在发酵培养基中分别加入5%的新鲜鸡羽毛粉、5%的水解鸡羽毛粉、5%的膨化鸡羽毛粉，其他组分不变，测定不同氮源条件下发酵液的酶活力。

1.5 新鲜鸡羽毛粉对D5产蛋白酶影响的测定

在发酵培养基中加入浓度分别为2%、3%、4%、5%的新鲜鸡羽毛粉，其他条件不变，测定不同浓度的新鲜鸡羽毛粉下发酵液的酶活力。

1.6 葡萄糖对D5产蛋白酶影响的测定

配制最佳发酵培养基，在发酵培养基中加入浓度分别为0.0%、0.5%、1.0%、2.0%的葡萄糖，其他条件不变，测定不同浓度的葡萄糖下发酵液的酶活力。

1.7 蛋白胨对D5产蛋白酶影响的测定

配制最佳发酵培养基，在发酵培养基中加入浓度分别为0.0%、0.5%、1.0%、2.0%的蛋白胨，其他条件不变，测定不同浓度的蛋白胨下发酵液的酶活力。

1.8 Mg2＋对D5产蛋白酶影响的测定

配制最佳发酵培养基，在发酵培养基中加入浓度分别为0.00%、0.01%、0.02%、0.04%的硫酸镁，其他条件不变，测定不同浓度的Mg2＋下发酵液的酶活力。

1.9 起始pH值对D5产蛋白酶影响的测定

配制最佳发酵培养基，分别调节pH值为6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，测定不同pH 值下发酵液的酶活力。

1.10 培养时间对D5产蛋白酶影响的测定

配制最佳发酵培养基，培养时间分别为3、4、5d，其他条件不变，测定不同培养时间下发酵液的酶活力。

1.11 角蛋白酶酶活力的测定

采用Folin－酚试剂法［9］，将各发酵液50℃水浴1h，以TCA作为空白对照液（不水浴），其他步骤相同。在680nm波长下测定各发酵液吸光度和空白对照液吸光度，根据公式“酶活＝（发酵液吸光度－空白对照液吸光度）×100×稀释倍数”计算酶活。

2 结果与分析

2.1 不同氮源对酶活的影响

不同氮源条件下，发酵液酶活的测定结果见图1。

图1 不同氮源对酶活的影响

由图1可知，菌株利用水解鸡羽毛粉的能力比利用其他氮源的能力强，酶活较高。因此，应选择水解鸡羽毛粉作为D5的氮源。

2.2 不同浓度新鲜鸡羽毛粉对酶活的影响

不同浓度新鲜鸡羽毛粉条件下，发酵液酶活的测定结果见图2。

图2 不同浓度新鲜羽毛粉对酶活的影响

由图2可知，菌株利用浓度为2%的新鲜鸡羽毛粉的能力比其他浓度的新鲜鸡羽毛粉能力强，酶活较高。因此，应将2%的新鲜鸡羽毛粉作为菌株D5产酶的最适酶活的浓度。

2.3 不同浓度葡萄糖对酶活的影响

不同浓度葡萄糖条件下，发酵液酶活的测定结果见图3。

图3 不同浓度葡萄糖对酶活的影响

由图3可知，菌株利用浓度为2%的葡萄糖的能力比其他浓度的葡萄糖能力强，酶活较高。因此，应将2%的葡萄糖作为菌株D5产酶的最适酶活的浓度。

2.4 不同浓度蛋白胨对酶活的影响

不同浓度蛋白胨条件下，发酵液酶活的测定结果见图4。

图4 不同浓度蛋白胨对酶活的影响

由图4可知，菌株利用浓度为2%的蛋白胨的能力比其他浓度的蛋白胨能力强，酶活较高。因此，应将2%的蛋白胨作为菌株D5产酶的最适酶活的浓度。

2.5 不同浓度Mg2＋对酶活的影响

不同浓度Mg2＋条件下，发酵液酶活的测定结果见图5。

图5 不同浓度硫酸镁对酶活的影响

由图5可知，菌株利用浓度为0.04%的硫酸镁的能力比其他浓度的硫酸镁能力强，酶活较高。因此，应将0.04%的Mg2＋作为菌株D5产酶的最适酶活的浓度。

2.6 不同起始pH值对酶活的影响

不同起始pH值条件下，发酵液酶活的测定结果见图6。

图6 不同pH值对酶活的影响

由图6可知，菌株在pH 6.5的条件下产酶的酶活最高。因此，应将pH 6.5作为菌株D5产酶的最适酶活的pH值。

2.7 不同培养时间对酶活的影响

不同培养时间条件下，发酵液酶活的测定结果见图7。

图7 不同培养时间对酶活的影响

由图7可知，菌株在培养第3天时产酶的酶活最高。因此，应将培养3d作为菌株D5产酶的最适酶活的培养时间。

3 讨 论

培养基的起始pH值、培养时间等培养条件和培养基的组成对菌株的生长有很大的影响［10］。通过试验测定不同因素条件下的酶活，确定产角蛋白酶菌株D5的优化培养基为：新鲜鸡羽毛粉2.00%，酵母膏2.00%，磷酸二氢钾0.05%，硫酸铵0.05%，蛋白胨2.00%，硫酸镁0.04%，氯化锌0.01%；优化发酵条件为：温度37 ℃，pH 6.5，装量80 mL／250mL锥形瓶，转速150r／min，培养时间3d。

［1］ 曾毅，李忠琴，许小平.角蛋白酶的研究进展［J］.海峡药学，2004，16（6）：102－131.

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