父亲年龄对精子基因组及子代健康的影响

刘小章 岳焕勋

1.成都中医药大学，四川省人口和计划生育科研所（610041）；2.四川大学华西第二医院

由于多种社会经济因素，推迟生育已成为现代社会的普遍趋势，由此引发了许多对隐藏在生育高龄化过程中的风险和后果的担忧［1-4］。女方高龄是不孕、流产、子代遗传缺陷最重要的危险因素已获得公认。虽然男方是否也存在类似的年龄依赖效应尚不明了，但文献中已有大量有关年龄对生殖激素生成、性功能、睾丸组织结构、精液质量、生育力的影响［4-6］，以及父亲高龄与不良生育结局和遗传缺陷相关的证据［7-10］。对高龄父亲的年龄尚无明确界定，通常以受孕时男方≥40岁为标准［11］。

由于年龄、生活方式及环境因素密切相关，在生育研究中区分父、母年龄影响的难度较大。直接评价雄性生殖细胞则可绕开这一难题，从而识别单纯父系危险因素［5，12］。

1 高龄男子染色体改变

染色体畸变是最先观察到的基因组完整性随年龄而下降的表现之一。人外周血淋巴细胞染色体分析证实各种基因组改变（非整倍体、易位、无着丝粒断片、染色体缺失、微核形成）的发生率随年龄呈线性增加［13］，引发了对男性生殖细胞某些染色体改变是否也会随年龄增加的担忧。

1.1 非整倍体

人类最常见的遗传性染色体异常，大多源于减数分裂过程中同源染色体不分离或染色体丢失［14-15］，是导致流产和不育的主要原因之一。45，X单倍体和16、21、22三倍体占非整倍体流产胚胎的60%。所有常染色体单倍体都是致死性的，仅13、18、21及性染色体三倍体胎儿可存活至出生（占初生儿的0.3%）［16］。已知母亲高龄是三体形成的高危因素，其风险呈线性（16三体）或呈指数性（21三体）增高［13］。父亲年龄是否与非整倍体发生相关仍有争议。人精子-仓鼠卵穿透实验揭示正常男子有2%～3%的精子携带非整倍体核型。有研究报告在控制母亲年龄后，父亲＞50岁，其子女发生21三体的风险为25～29岁父亲的2倍［17］；当母亲年龄≥40岁时，父亲年龄对子代罹患唐氏综合征的影响达到50%［18］，但父亲年龄对21三体及其他常染色体三体发生的影响并未被多数研究证实［5，13］。相对于常染色体，性染色体非整倍体则显示明显的父本传递特征。性染色体非整倍体总发生率约为0.2%。估计出生时约55%的性染色体非整倍体为父性起源，其比例在47，XXX、47，XXY、45，X、47，XYY分别为6%、50%、80%、100%［13-19］。应用荧光原位 杂交技术（FISH）研究性染色体，结果提供了雄性生殖细胞内年龄相关非整倍体增加的证据。在11篇精子FISH研究中，有9篇显示年龄对性染色体非整倍体发生有正向影响。＞50岁男子携带24，XY核型精子（第一次减数分裂错误）的风险和生成X或Y二倍体精子（第二次减数分裂错误）的频率分别增高2～3倍［12］。对二倍体精子发生率与父亲年龄的关联亦有争议，有报道年长男子二倍体精子发生率比年轻者约高2倍，而其他包括许多样本量较大的研究未发现类似影响［12-13］。

1.2 染色体结构异常

新生儿、死产胎儿及自然流产胚胎（或胎儿）的染色体结构异常发生率分别为0.25%、0.4%和2%。估计约80%的新生畸变源于雄性生殖细胞。正常健康男子精子染色体结构异常发生率为0～13%，平均6%～7%［19］。阵列对比基因组杂交分析确定携带平衡易位和异常表型男子全部新生微缺失均来源于父亲，其他研究报告100%的复发新生易位，即t（11；22）和96%的非复发平衡相互易位为父系遗传［20-21］。尽管表现出父系起源的强势，但相对于更容易检测的非整倍体综合征，活产儿染色体结构异常总体发生率低下，通过人类子代流行病学研究确定父亲年龄的影响一直极为困难。

啮齿动物研究首次发现精子染色体结构畸变随年龄增加的证据，但减数分裂前、后生精细胞所受影响不同，年长动物晚期精子细胞不稳定畸变率显著增高。通过精子传递的不稳定染色体畸变可能具有胚胎致死性，也可能在合子内被重排。年龄相关的精子不稳定损伤增加可能增加子代染色体重排的风险［13］。采用人精子-仓鼠卵穿透实验发现，≥45岁已生育男子的精子染色体结构异常为20～24岁男子的4倍（13.6%，2.8.0%）。Sloter等［13］对这些数据进行了重新分析，证实该影响几乎全是由于染色体断裂的显著增加，无着丝粒断片增加不明显，提示减数分裂后缺乏DNA修复的精子细胞尤其易受老龄化影响。Sartorelli等［22］观察到捐精者年龄与精子染色体结构畸变率呈极显著正相关，在年长捐精者中可见高发生率的无着丝粒断片及复杂放射体。利用精子FISH检测，有研究发现1号染色体着丝粒缺失发生率与捐精者年龄显著相关［23］，9号染色体着丝粒和亚端粒区域重复和缺失率随年龄呈线性上升，每10年结构畸变增加14.6%～28%［24］。Sloter等［25］报告年长男子（65～80岁）精子1号染色体片段重复及缺失率、1q12脆性位点区染色体断裂率分别为22～28岁男子的2倍和1倍。运用多色多染色体FISH方法，Templado等［26］发现年长男子所有精子常染色体结构异常（重复与缺失）均显著高于年轻男子（6.6%，4.9%），并证实无论年龄大小重复发生率均超过缺失（2：1）。对过多重复的可能解释是其中某些新生异常来源于有丝分裂而非减数分裂重组或携带染色体缺失生殖细胞在精子发生期间的被动选择。

2 精子DNA损伤

精子DNA完整性是正常受精和胚胎发育的重要决定因素之一。精子DNA损伤（DNA碎片、染色质包装异常及鱼精蛋白缺陷）对自然受孕和辅助生殖技术治疗结局具有负面影响［27-28］。大多数排出精液都含有携带DNA碎片的精子亚群。多项研究证实精子 DNA 碎片指数（DFI）随年龄而上升［29-32］，精子前向活动率［29］、精子细胞凋亡［31］随年龄而下降。≥45岁男子精子DFI为＜30岁男子的一倍（32.0%，15.2%）［33］，≥40岁男子严重精子 DNA损伤（DFI＞30%）的发生率几乎为＜40岁男子的6倍（17%，3%）［29］。Wyrobek等［34］发现20～80岁之间精子DFI逐渐增高达5倍，无明显年龄界限，认为DFI上升是呈渐进性的。也有研究报告年长男子射出的精子中早期凋亡生物标记（浆膜磷脂酰丝氨酸转位）表达显著升高［35］，并可见睾丸生殖细胞DNA损伤修复相关蛋白和凋亡标记物的表达有显著差异［36］。年龄相关的DNA断裂增加和细胞凋亡失调的净效应造成更多缺陷精子排出。早期凋亡（或凋亡低表达）或有DNA损伤但形态正常的精子能够有效受精，如果这些核苷酸或DNA损伤未被卵子修复，则可导致胚胎发育不良、流产以及其他不良生育结局［29，37-39］。尽管文献中的数据并不完全一致，但支持精子DNA完整性随年龄增长而下降的证据越来越多。

精子DNA损伤的机制包括精子发生过程中细胞凋亡失调、精子染色质重构期间生成DNA断裂、精子经生殖道运行期间氧自由基（包括羟基自由基和一氧化氮）诱发睾丸后DNA碎片、内源性凋亡蛋白酶及核酸内切酶诱发DNA碎片、放疗或化疗以及环境毒物诱导DNA损伤等［40］。推测越来越多的氧化应激可能在年龄相关的精子DNA损伤增加中起作用［12，29，41］。此外，错配、碱基切除、核苷酸切除、双链断裂等修复效率可能受老龄化影响而改变，在年龄相关DNA损伤中起辅助促进作用。

3 父亲高龄与子代的遗传风险

父亲高龄与自发先天性疾病和常见复杂疾病（如某些癌症、精神分裂症、自闭症等）风险增高相关［4，11，42］，父亲＞50岁，其子女发生软骨发育不全（ACH）及 Apert、Pfeiffer、Crouzon综合征的风险分别为＜30岁父亲的8～12倍、9.5倍、8倍及6倍；父亲＞40岁，其子女发生自闭症的风险为＜30岁父亲的5.75倍；父亲≥50岁，其子女发生精神分裂症的风险为20～24岁男子的2.96倍［11］。受老龄化累及的表观遗传印迹改变也可能参与了高龄男子后代对多因素起源疾病的易感性［16，43］。

全基因组测序研究证实由父亲传代的突变数量远远高于母亲，父亲年龄是决定突变率的主要因素［44-45］。可能是由于男性生殖细胞周而复始增殖所经历的有丝分裂远多于女性，50岁时精原细胞（SSCs）分裂已达840次，而卵子发生的24次分裂在出生前已全部完成［46］。随每一次细胞分裂，基因组复制都可能引入复制错误突变。其他年龄依赖因素，如DNA复制保真度降低、修复效率低下、或诱变剂反复暴露也可能参与了复制错误的累积。父亲年龄与新生基因突变数量的正相关已得到若干常染色体和X染色体显性遗传疾病数据的支持［47］。

与父亲高龄关联最强的是FGFR2、FGFR3、RET、HIRAS及PTPN11基因中单碱基替换突变所导致的常染色体显性疾病ACH、Apert、Pfiffer、Crouzon、Muenke、Costello及Noonan综合征、以及2A和2B型多发性内分泌肿瘤，这类疾病又被称作父本年龄效应（PAE）疾病，以极端父性突变起源偏向、显著年龄影响及生殖细胞高突变率为特征［48］。除复制错误递增假说，Goriely等［48］根据直接量化精子和睾丸内PAE突变的证据，提出PAE是通过生长因子受体-RAS信号传导通路分子介导的SSCs行为失调。PAE编码突变蛋白赋予SSCs选择优势，具有功能获得性的突变SSCs在正常睾丸内以类似肿瘤发生的过程被主动选择和进行性克隆扩增［49］，这种"自私选择"过程导致突变精子随时间推移而富集。

与典型PAE疾病关联的致病等位基因生殖适合度低下会被迅速淘汰，选择优势较弱的中性和轻度致病突变则可能遗传或累积数代，仅在突破一定“突变阈值”后影响后代健康。父亲和祖父辈年龄可能助长子代的突变负荷，从而导致疾病风险增高［50-53］。

高龄男子的精子经历更频繁的年龄相关改变，可能导致各种后果，不仅对男子自身生育状态，同时可能对其子女及数代人的健康和生存能力产生永久性影响。随着父亲年龄的增加，父性基因组新生突变的数量也在累加（每年新增2个突变）［44］。父亲高龄被认为是人类新生突变的主要原因。为减小高龄相关的风险，一些国家将供精者年龄上限定为40岁，甚至30岁［54］。男子中年后（＞40岁）生育力下降、妊娠并发症及生育罹患某种疾病子女的风险增高似乎已成共识［5，41，55］。将准备做父亲的男子纳入现有计划生育和产前保健框架，向男、女双方提供有关年龄对配子质量影响的咨询，有利于优化妊娠结局。另外，不断进展的单细胞全基因组测序技术［56-57］有望直接量化单个精子细胞携带的突变负荷，为体外受精植入前胚胎遗传学诊断，以及母血中游离胎儿DNA产前筛查等提供了临床应用前景。

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