乳酸菌环境胁迫应答分子机制研究进展

赵亚荣，张文羿，孙天松

(内蒙古农业大学 乳品生物技术与工程教育部重点实验室，呼和浩特010018)

0 引 言

乳酸菌(Lactic acid bacteria)是一类能够发酵乳糖生成乳酸的细菌，且在自然界中分布广泛。作为益生菌的乳酸菌对人体健康起着至关重要的作用，与此同时，作为重要的工业微生物，乳酸菌菌体及其代谢产物已被广泛应用于食品、药物、饲料和精细化学品等领域[1-3]。但乳酸菌在其生产和应用中都不可避免的面临着多种环境胁迫。在发酵过程中，由于乳酸的大量积累和氧的存在对乳酸菌造成酸胁迫和氧胁迫；在乳酸菌冷冻干燥过程中，由于极低的环境温度对乳酸菌造成冷胁迫；在人体胃肠道应用过程中，胆盐的存在以及营养物质的缺乏均会对乳酸菌造成一定程度的胁迫。这些胁迫环境会明显导致乳酸菌生理状况的恶化，进而影响其发酵和代谢产物的生成。因此，了解乳酸菌在不同环境胁迫下的分子机制，对更好的利用乳酸菌具有实际的指导意义。

1 细菌应激反应

面对环境的突变，细菌会做出一系列的应激反应，从而更益于其在自然界中生存。如同其它细菌，乳酸菌对胁迫环境的敏感性及其所具有的抵御该环境的能力，使得其可以忍受恶劣的生存环境。理论上，细菌的每一个基因都具有特定的调节功能，并且能在一定的环境中进行表达。其中有些功能是受多个基因调节的，细菌对于环境胁迫的应激反应便是一个很好的例子。Stortz等证实细菌的应激反应主要是依靠基因的共同表达来调节细胞的生理过程 (细胞分裂，DNA代谢，看家基因表达，细胞膜的合成以及运输等)，从而提高细菌的抗环境胁迫能力[4]。

适应性反应是乳酸菌应激反应中最常见的现象。当细胞处于胁迫环境中，由适应性反应所诱导的保护作用可保护细胞抵御更为恶劣的条件，从而有效提高乳酸菌的存活率。而交互保护作为另一种应激反应，在提高乳酸菌胁迫条件下的存活率和改进工艺性质方面具有重要作用。薛峰等研究了不同预适应条件对干酪乳杆菌 ATCC393存活的影响，研究结果表明，分别经热、酸、过氧化氢和胆盐预适应的细胞均能诱导交互保护作用[5]。乳酸菌胁迫机理的研究一方面能进一步挖掘成熟菌株的应用潜力，同时也为筛选具有高胁迫抗性的优良菌株提供了可借鉴的思路。

2 乳酸菌环境胁迫机理

目前，对乳酸菌环境胁迫机制的研究主要包括酸胁迫、冷胁迫、胆盐胁迫、氧胁迫以及营养胁迫。研究益生菌环境胁迫机制需要一个特定的综合系统，其研究方法包括传统生物学手段、蛋白质组学、基因组学以及代谢组学。其中，蛋白质组学是研究细菌在环境胁迫条件下应激机理的最可靠手段，此方法可分析在特定的时间和条件下，一个细胞或生物样品中所表达的所有蛋白质[6]。O＇Farrell等提出的双向凝胶电泳法(Two-dimensional gel electrophoresis，2-DE)是蛋白质组学研究的核心技术[7]。此前，蛋白质组学仅是用于对蛋白质的分离，利用双向电泳技术构建蛋白质表达图谱，从而分离出蛋白质。而现在，蛋白质组学为研究乳酸菌在胁迫环境中的生理反应提供了新的借鉴和思路。

2.1 酸胁迫

乳酸菌可发酵乳糖产生乳酸，从而降低生长环境的pH，而pH的变化会对菌体的发酵能力和代谢产物产生一定影响，值得关注的是，乳酸菌在食品加工过程中所遇到的酸抑制和在通过人体胃肠道时所经历的低pH环境的应答机制是不同的[8]。

研究发现，低pH环境会诱导乳酸菌产生各种分子伴侣、酶以及氨基酸，这些物质会参与其酸应激，并对菌体在酸应激过程中维持pH动态平衡以及细胞的修复具有重要作用。Sanchez等研究了长双歧杆菌在低pH环境中的应答和适应性机制，发现在此环境中，与糖酵解相关的一些酶被诱导合成，其中α-1,4-糖苷酶，磷酸葡萄糖变位酶和UDP-4-葡萄糖异构酶均被上调[9]。结合蛋白质组学和转录组学对德氏乳杆菌保加利亚亚种 (Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus)在低pH值环境中进行研究，发现在酸胁迫下也会诱导产生大量的分子伴侣(GroES，GroEL，HrcA，GrpE，DnaK，DnaJ，ClpE，ClpP，ClpL) 以及与脂肪酸合成相关的基因(fabH，accC，fabI)，而使类异戊二烯合成的甲羟戊酸途径的基因(mvaC,mvaS)受到抑制[10]，从而帮助菌体来适应该胁迫环境。在对干酪乳杆菌Lactobacillus casei Zhang的研究中，研究者发现天冬氨酸也参与了酸胁迫的耐受性。实验以野生菌株做为对照进行研究，发现在pH3.5的条件下变异株细胞内的天冬氨酸和精氨酸的含量均高于野生菌株，表明天冬氨酸和精氨酸可提高菌体对酸的耐受性[11]。

2.2 胆盐胁迫

乳酸菌对胆盐耐受能力的大小是检验其在人体肠道中能否存活的指标之一。胆盐具有杀菌作用，它不仅可以破坏细胞膜，而且还会使DNA氧化受损。乳酸菌可产生胆盐水解酶 (Bile Salt Hydrolases，BSH)将胆盐进行解共轭，同时使类固醇物质水解成为氨基酸或牛磺酸，此水解酶可以改变胆盐的特性，从而大大降低其在低pH环境中的溶解性。在高胆盐环境中，各种相关酶的表达会发生显著变化。Yokota等首次研究证明乳酸菌和双歧杆菌的膜蛋白与胆盐胁迫具有密切的关系，该膜蛋白可以使胆盐从细胞中流出[12]。采用蛋白质组学观察长双歧杆菌在胆盐环境中的生长情况，发现许多与双歧分流相关酶的表达上调[13]。在动物双歧杆菌乳酸亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)中发现此类与胆盐耐受相关的酶均参与了该菌株糖类的代谢。而且，参与菌体细胞氧化还原状态的相关蛋白质也受到胆盐的影响，这可能是与细胞内部的NADH和FAD+的浓度有关系。

乌日娜等对L.casei Zhang在1.5%胆盐的培养基中生长的蛋白质组进行分析，发现有26种蛋白质表达发生了变化，如细胞膜保护蛋白、代谢关键酶等[14]。当乳酸菌处于胆盐胁迫环境中时，利用2-DE法对其蛋白质学进行研究，发现在保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)和粪肠球菌(Enterococcus faecalis)中分别有23个和45个与细胞质相关的蛋白被上调[15]，已有研究证实，大部分此类蛋白质都与细菌耐受胆盐胁迫环境有关。利用蛋白质组学与转录组学相结合的手段，对鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)LGG在0.2%的胆盐中的耐受性进行研究，结果其转录组和蛋白质组的基因表达均会有差异[16]。

2.3 冷胁迫

乳酸菌作为发酵剂在加工和贮存过程中一般处于低温环境中。低温环境不仅影响细胞活性，损伤细胞膜的形态及其流动性，而且还影响DNA的复制、转录和翻译。生物体自身为了克服此种影响会诱导产生大量蛋白，称为冷诱导蛋白 (cold-induced proteins，CIPS)，不同乳酸菌个体在冷胁迫下诱导形成的CIPS的数量不同，如乳杆菌、嗜热链球菌可分别诱导产生22和24种蛋白质。其中分子量大约7.5kDa的冷诱导蛋白被称为冷激蛋白(cold-shock proteins，Csp)。 冷激蛋白的数量会因菌种的不同而不同，乳酸链球菌乳酸亚种IL1403和植物乳杆菌C3.8只有2个Csp基因，植物乳杆菌NC8有3个Csp基因，而乳酸乳球菌乳脂亚种MG1363中却含有7个Csp基因(CspA-CspG)[17-18]。 Kim等研究发现Csp的诱导机制非常复杂，但似乎都是控制在转录后水平[19]。研究表明，很多乳酸菌对低温环境的适应性与其之前所生存的环境具有密切的关系，Wang等对嗜酸乳杆菌的蛋白质组进行分析，发现经过一个温和的低温过渡环境(28℃)能够提高细胞对寒冷环境的适应能力[20]。还有研究表明菌体先在26℃环境中生存8小时会到达其最适的耐受寒冷的能力，在德氏乳杆菌保加利亚亚种中发现菌株先受到酸胁迫(pH5.25中30min)，也可提高其对低温环境的适应能力[21]。乳酸菌在不同温度环境中其蛋白表达也存在差异。

2.4 高温胁迫

众所周知，菌体细胞均有最适生长温度，温度太高时会引起蛋白降解，进而引起核糖体和RNA等一些大分子物质的不稳定性，并且细胞膜流动性也会发生改变。热激反应的特征是诱导产生一系列伴侣蛋白和蛋白酶，称为热激蛋白(Heat Shock Protein，HSP)。 在乳酸菌中，热应激条件下所诱导产生的热激蛋白数量是不同的，如粪肠球菌中34个、乳酸乳杆菌17个、变异链球菌40个，而在此40个中，只有6个是上调的。Whitake和Auffary等利用2D-PAGE法对热激环境中的乳酸乳球菌进行研究，发现在该胁迫环境下，乳酸乳球菌诱导产生了热激蛋白 (DnaK、GroEL和GroES)[22-23]。同样，利用蛋白质组学的方法发现在热激环境下，副干酪乳杆菌NFBC 338中会诱导产生GroEL。HSP的表达的动力学会随着热激反应发生变化，例如菌体刚进入高温环境就会产生热激蛋白DnaK和GroEL，而其他的HSP是在进入高温环境一段时间后才会产生。

在高温环境下，乳酸乳杆菌和副干酪乳杆菌中编码GroESL的基因过表达，但仍不能够消除高温环境对菌体的影响，这是因为菌体内其它蛋白质没有对此环境做出适应性反应。德氏乳杆菌保加利亚亚种在65℃热激10 min后，通过HSP的合成会使得菌株的死亡率降低，但如果早期的HSP合成受阻，则菌体的死亡率会大大增加[24]。

在嗜酸乳杆菌中，通过转录和翻译诱导某些HSP产生。其中，对mRNA的分析主要集中在ftsH基因和CIRCE调控基因(DnaJ，GroESL和HrcA-GrpE-DnaK)上。研究发现，热激10～15 min后，CIRCE基因的表达会提高10-100倍，而热激20 min时，该基因的表达受到了抑制[25]。与此同时，乳酸乳杆菌还会诱导产生一个ClpP基因和四个Clp-ATPase基因(ClpB,ClpC，ClpE和ClpX)，在高温环境中，这些基因均会做出相应的调控，从而保护菌体免受高温损伤。

2.5 氧胁迫

乳酸菌大部分为兼性厌氧菌，尽管氧气对菌体细胞本身没有损伤作用，但是在其代谢过程中所产生的活性氧 (Reactive Oxygen Species，ROS)(过氧化氢(H2O2)、超氧阴离子(O2-)以及过氧化自由基(O.))能引起脂类、蛋白质及DNA等的损伤，进而使菌体细胞受损[26]。氧胁迫由特定的转录因子控制，当ROS的浓度超过正常水平产生氧胁迫时，便可激活菌体的抵御机制，从而使菌体免受损伤。Mostertz等利用转录组学和蛋白质组学对枯草芽孢杆菌的氧胁迫进行了分析，结果显示经过氧化氢处理后，55种蛋白的合成上调，150种蛋白的合成下降。而经过超氧阴离子处理后，有60多种蛋白质被过量的表达，而200多种的表达受到了限制。这说明氧胁迫对于菌体蛋白质合成代谢具有很大的影响[27]。

Arena等对嗜热链球菌在氧胁迫环境中的适应性进行研究，利用蛋白质组学与双向聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D-PAGE)相结合的方法，对各种条件下所产生的氧胁迫的蛋白质表达进行分析，结果发现H2O2会促使大量应激蛋白的产生，其中包括可补偿由于氧化应激而引起缺失的特定蛋白质，例如，NADH氧化酶、Mn超氧化物歧化酶、谷胱甘肽还原酶以及Fe-S组件蛋白Suf B和Suf C，而与能量代谢相关的蛋白质却下调[28]。

2.6 营养胁迫

细菌在繁殖的过程中，如果不能及时补给营养物质，便会导致菌体进入饥饿状态，引发营养胁迫现象。值得关注的是，有时由于其它胁迫也会间接的使菌体出现营养缺乏的情况。例如，在酸胁迫时，一些转运子的活性降低，致使物质的利用率降低，这对菌体本身会产生不利影响。导致乳酸菌产生营养胁迫现象的主要原因有以下3种：(1)碳源胁迫，会使能量耗尽；(2)磷酸盐胁迫，会使能量以及RNA和DNA的合成受阻；(3)氮源胁迫，主要影响蛋白质的合成。

乳酸菌需要在稳定期维持较高的代谢能力。Kunji等指出在碳源胁迫时，乳球菌的存活能力与其糖酵解的能力相关。同样，也有研究发现氨基酸代谢在乳酸乳球菌应答碳源胁迫时起着很重要的作用，这说明该胁迫环境下代谢的调节极为重要。利用双向凝胶电泳对碳源胁迫下的乳酸乳杆菌进行研究，发现该胁迫环境诱导产生14个蛋白质。并且这些蛋白质多数是与碳水化合物及氨基酸的代谢有关[29-31]在乳酸乳杆菌中发现，当菌株处于氨基酸缺乏时，由鸟嘌呤合成(RelA)所调节的核苷酸代谢会做出反应，经研究，RelA是调节了控制蛋白水解通路的CodY基因[32]。

目前发现，乳酸乳杆菌中碳源缺乏会引起其它条件的胁迫，包括热胁迫、氧胁迫、酸胁迫、渗透压胁迫等。在对保加利亚乳杆菌研究发现，当乳糖缺乏时，菌株对于热胁迫、酸胁迫和胆盐胁迫的抵抗能力增强。

大多数的乳酸菌处于胁迫环境还会产生协同保护作用现象，Wall等指出，罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)在高胆盐环境中会诱导产生某些蛋白质，这些物质对菌体具有一定的保护作用[33]。De Anqelis M在对旧金山乳杆菌(Lactobacillus sanfranciscensis)CB1的研究中发现，当菌体处于较低pH环境时，与高温胁迫相关的分子伴侣 (DnaJ,DnaK,GroES和GrpE)也会被诱导，但只有GrpE水平上调[34]，而这些酶均参与复杂碳水化合物的代谢，这说明在酸胁迫条件下，菌体的代谢会发生改变。

3 结束语

对乳酸菌在各种胁迫环境下的分子机理进行研究，不仅可以了解其应答机制，而且更重要的是可以挖掘出优良的益生菌菌株，开发新的益生菌产品。尽管人们对乳酸菌胁迫环境中的抵御机制的研究取得了进展，但是仍然有些问题未得到解决，包括各种胁迫环境的交叉保护现象等，这些内在的联系必须采用其它手段(如：代谢工程技术等)进行深入细致的研究。相信随着基因测序技术的成熟以及基因组数据的大量积累，结合分子生物学的基础知识对乳酸菌的信息表达进行再挖掘，定会为其更为充分的利用提供宝贵资料。

[1]PARVEZ S,MALIK K A,KANG S A,et al.Probiotics and Their Fermented Food Products are Beneficial for Health[J].J Appl Microbiol,2006,100:1171-1185.

[2]DE A M,GOBBETTI M.Environmental Stress Responses in Lactobacillus:A Review[J].Proteomics,2004,4:106-122.

[3]BURGESS C,O'CONNELL-MOTHERWAY M,SYBESMA W,et al.Riboflavin Production in Lactococcus lactis:Potential for in Situ Production of Vitamin-Enriched Foods[J].Appl Environ Microbiol,2004,70:5769-5777.

[4]STORTZ G,HENGGE-ARONIS R.Bacterial Stress Response[M].ASM Press,Washington,D C.2000:285.

[5]薛峰,张娟,堵国成，等.交互保护对干酪乳杆菌 ATCC393TM存活的影响[J].微生物学报,2010,50:478-484.

[6]DIERICK J F,DIEU M,REMACLE J,et al.Proteomics in Experimental Gerontology[J].Exp Gerontol,2002,37:721-734.

[7]乌日娜,张和平,孟和等.干酪乳杆菌蛋白质双向电泳条件优化及图谱建立[J].食品与生物技术学报,2009,28(5):598-602.

[8]CORCORAN B M,STANTON C,FITZGERALD G,et al.Life Under Stress:The Probiotic Stress Response and How It May be Manipulated[J].Curr Pharm Des,2008,14:1382-1399.

[9]CAESCU C,VIDAL O,KRZEWINSKI F,et al.Bifidobacterium Longum Requires a Fructokinase for Fructose Catabolism[J].J Bacteriol,2004,186:6515-6525.

[10]FRENANDEZ A,OGAWA J,PENAUD S,et al.Rerouting of Pyruvate Metabolism During Acid Adaption in Lactobacillus bulgaricus[J].Proteomics,8:3154-3163.

[11]WU C,ZHANG J,CHEN W,et al.A Combined Physiological and Proteomic Approach to Reveal Lactic-acid-induced Alterations in Lactobacillus casei Zhang and Its Mutant with Enhanced Lactic acid Tolerance[J].Appl Microbiol Biotechnol,2012,93(2):707-722.

[12]YOKOTA A,VEENSTRA M,KURDI P.Cholate Resistance in Lactococcus lactis is Mediated by an ATP-dependent Multispecific Organic Anion Transporter[J].J Bacteriol,2000,182:5196-5201.

[13]SANCHEZ B,CHAMPOMIER-VERGES M C,ANGLADE P,et al.Proteomic Analysis of Global Changes in Protein Expression during Bile Salt Exposure of Bifidobacterium longum NCIMB 8809[J].J Bacteriol,2005,(187):5799-5808.

[14]乌日娜.益生菌 Lactobacillus casei Zhang蛋白质组学研究[D].呼和浩特:内蒙古农业大学,2009.

[15]RINCE A,FLAHAUT S,AUFFRAY Y.Identification of General Stress Genes in Enterococcus faecalis[J].Int.J.Food Microbiol,2000,55:87-91.

[16]KOSKENNIEMI K,LAAKSO K,KOPONEN J,et al.Proteomics and Transcriptomics Characterization of Bile Stress Response in Probiotic Lactobacillus rhamnosus GG[J].Mol Cell Proteomics,2011,10(2):M110 002741.

[17]WOUTERS J A,JEYNOV B,ROMBOUTS F M,et al.Analysis of the Role of 7 kDa Cold-shock Proteins of Lactococcus Lactis MG1363 in Cryoprotection[J].Microbiology,1999,145:3185-3194.

[18]DERZELLE S,HALLET B,FRANCIS K P,et al.Changes in CspL,CspP and CspC mRNA Abundance as a Function of Cold Shock and Growth Phase in Lactobacillus plantarum [J].J Bacteriol,2000,182:5105-5113.

[19]KIM W S,PERL L,PARK J H,et al.Assessment of Stress Response of the Probiotic Lacto-bacillus Acidophilus[J].Curr Microbiol,2001,43:346-350.

[20]WANG Y,DELETTRE J,GUILLOT A,et al.Infiuence of Cooling Temperature and Duration on Cold Adaptation of Lactobacillus acidophilus RD758[J].Cryobiology,2005,50:294-307.

[21]STREIT F,CORRIEU G,BEAL C.Acidification of Fermented Broth Improves Crytolerance of Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus CFL1[J].J Biotechnol,2007,128:659-667.

[22]WHITAKE R D,BATT C A.Characterization of the Heat Shock Response in Lactococcus lactis subsp.lactis[J].Appl Environ Microbiol,1991,57:1408-1412.

[23]AUFFARY Y,GANSEL X,THAMMAVONGS B,et al.Heat Shock-induced Protein Synthesis in Lactococcus lactis subsp.lactis[J].Curr Microbiol,1992,24:281-284.

[24]GOUESBET G,JAN G,BOYAVAL P.Two-dimensional Electrophoresis Study of Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus Thermotolerance[J].Appl Environ Microbiol,2002,68:1055-1063.

[25]KILSTRUP M,JACOBSEN S,HAMMER K,et al.Induction of Heat Shock Proteins DnaK,GroEL,and GroES by Salt Stress in Lactococcus lactis[J].Appl Environ Microbiol,1997,62:1826-1837.

[26]MIYOSHI A,ROCHAT T,GRATADOUX J J,et al.Oxidative Stress in Lactococcus lactis.Review[J].Genet Mol Res,2003,2:348-359.

[27]MOSTERTZ J,SCHARF C,HECKER M,et al.Transcriptome and Proteome Analysis of Bacillus subtilis Gene Expression in Response to Superoxide and Peroxide Stress[J].Microbiology,2004,150:497-512.

[28]ARENA S,DMBROSIO C,RENZONE G R,et al.A Study of Streptococcus thermophilus Proteome by Integrated Analytical Procedures and Differential Expression Investigations[J].Proteomics,2006,6:181-192.

[29]KUNJI E R,UBBINK T,MATINV A,et al.Physiological Responses of Lacotococcus lactis ML3 to Alternating Conditions of Growth and Starvation[J].Arch Microbiol,1993,159:372-379

[30]HARTKE A,GIARD J C,LAPLACE J M,et al.Survival of Enterococcus faecalis in an Oligotrophic Microcosm:Changes in Morphology,development of General Stress Resistance,and Analysis of Protein Synthesis[J].Appl Environ Microbiol,1998,64:4238-4245.

[31]SVENSATER G,SJOGREEN B,HAMILTON I R.Multiple Stress Responses in Streptococcus Mutans and the Induction of General and Stress-specific Protein[J].Microbiology,2000,146:107-117.

[32]GUEDON E,SERROR P,EHRLICH S D,et al.Pleiotropic Transcriptional Repressor CodY Senses the Intracellular Pool ofBranchedchain Amino Acids in Lactococcus lactis[J].Mol Microbiol,2001,40:1227-1239.

[33]WALL T,BATH K,BRITTEN A,et al.The Early Response to Acid Shock in Lcatobacillus reuteri involves the ClpL Chaperone and a Putative Cell Wall Altering Esterase[J].Appl Environ Microbiol,2007,73:3924-3935.

[34]DE ANQULIS M,BINI L,PALLINI V,et al.The Acid-sterss Response in Lactobacillus sanfranciscensis CB1[J].Microbiology.147(7):1863-1873.