遗传标记是动物分子育种的基础

文│郭春燕（山西晋中职业技术学院）

迄今为止，畜禽育种工作已经取得了巨大的进展，畜牧生产水平也得到了极大的提高。然而在20世纪90年代，由于畜禽选种理论和技术发展缓慢，导致了遗传改良的速度也呈现了变慢的趋势。正是在这一时期，随着分子生物学和基因组学的飞速发展，不断提出了新的动物育种方法。以分子数量遗传学为理论基础的动物分子育种也应运而生。以基因组分析和转基因动物技术为依托的分子育种技术是建立在对各种遗传标记不断研究的基础之上，本文就动物分子育种的遗传标记发展情况作一概述。

一般来讲，遗传标记是指可以明确反映遗传多态性的生物特征，即遗传标记是指一些等位基因或遗传物质，其表型易于识别且遵循孟德尔遗传方式遗传。遗传标记最早可以见于20世纪50年代的微生物遗传研究领域。遗传标记的发展经历了形态和生理标记，到细胞学、免疫学标记和生化标记，再到后来的DNA分子标记。纵观遗传学发展的历史，每一种新型遗传标记的发现，都大大推进了遗传学的发展，从而促进了动物育种实践。

一、传统的遗传标记

根据动物能够明显显示遗传多态性的外观性状，如毛色、角形、耳形、冠形等可以作为品种特征的标志。有些形态标记由于与某些经济性状相关联，在育种学上还具有特殊的经济意义，如利用鸡的矮小基因成功地培育了矮小型蛋鸡。通过对不同物种染色体形态、数目和结构的研究，发现了染色体变异以及各种异形染色体等都有其特定细胞学特征，可以作为一种遗传标记来测定基因所在的染色体及其相对位置。

免疫学标记是以动物的免疫特性为基础的遗传标记，主要包括红细胞抗原、白细胞抗原和淋巴细胞抗原等。白细胞表面抗原类型又称为主要组织相容性复合体（MHC），它是由一系列紧密连锁具有高度多态的基因座位所组成的一个遗传区域。由于MHC在动物机体的免疫系统中发挥着极其重要的作用并与家畜疾病的抗性和易感性之间有着非常密切的关系，从而成为疾病抗性和易感性的重要候选标记基因。20世纪50年代，许多科学家发现同一种蛋白质（或酶）可具有多种不同的形式。同时，随着凝胶电泳技术的发展和组织化学染色法的应用，显示蛋白质多态性的带型可以肉眼辨别，从而以生化遗传学为基础建立了生化遗传标记。

二、DNA标记

DNA标记是在20世纪70年代以后随着分子生物学技术的发展而逐渐发展起来的，相对于传统的遗传标记而言，它是一种新的以DNA多态性为基础的遗传标记，具有许多优点。

一是由于是直接反映DNA分子水平上的变异，因而能对各发育时期的个体，各个组织、器官甚至细胞作检测，既不受环境的影响，也不受基因表达与否的限制，为研究工作提供了极大的便利；二是DNA标记的等位点变异水平比表型标记丰富得多，即多态性很高，以致无须专门创造特殊的遗传材料；三是其数量极大，几乎是无限的，遍及整个基因组；四是DNA标记对生物体通常没有不良影响，也不影响生物性状的表现，即表现为“中性”；五是多数DNA标记表现为共显性，能分辨所有的基因型。DNA标记的这些特性，奠定了它具有广泛应用性的基础。

1980年，Botstein等首先提出了DNA限制性片断长度多态性标记（RFLPs标记）可以应用于DNA多态性的研究。之后相继出现了小卫星DNA、随机扩增多态DNA标记（RAPD标记）、微卫星DNA标记、扩增片断长度多态性标记（AFLPs标记）及单核苷酸多态性标记（SNPs）等。根据DNA多态性检测手段的不同，可将DNA标记分为以下四类。

1.基于DNA-DNA杂交的DNA标记。这类标记的检测是利用限制性内切酶酶切及凝胶电泳分离不同个体的DNA分子后，用经标记的特异DNA探针与之杂交，经放射自显影或非同位素显色技术来检测DNA的多态性，其中主要包括RFLPs和小卫星DNA。

RFLPs是指用限制性内切酶切割不同个体基因组DNA后，含有同源序列的酶切片断在长度上的差异。造成RFLPs多态性的原因主要是点突变导致的限制性位点改变和基因顺序重排（包括大的DNA片段缺失和插入）。与传统的遗传标记相比，RFLPs标记具有共显性遗传，稳定性好，无表型效应，数量大，不受年龄、性别、基因产物的影响等优点；缺点是多态信息含量低，而且操作复杂，耗时耗力，成本高，并且对模板DNA的质量要求较高、需求量大。在构建遗传连锁图和基因定位研究中，RFLPs是应用得较多的标记之一。

许多生物体的DNA存在大量的串联重复序列的高变异区。通常将以15～75个核苷酸为基本单元的串联重复序列称为小卫星。小卫星标记产生的多态性是由同一座位上的串联单元数量的不同产生的。由特定的DNA探针与小卫星DNA序列杂交可产生类似于人指纹的DNA指纹。DNA指纹图具有多座位性，高变异性和简单而稳定的遗传等特点，但是由于其在基因组内呈非随机分布，故较少用于畜禽遗传图谱的构建和育种实践中。

2.基于PCR的DNA标记。这类标记是在1985年聚合酶链式反应（PCR）技术问世以后才逐渐发展起来的。根据所用引物的特点，又将这类DNA标记分为随机引物的PCR标记和特异引物的PCR标记两类，其中的典型代表分别是RAPD标记和微卫星DNA标记。

RAPD标记所用的引物长度通常为9～10个碱基，大约只有常规PCR引物长度的一半。由于引物较短，所以在PCR中必须使用较低的退火温度，以保证引物能与模板DNA结合。此外，由于使用了较短的引物，其PCR易受条件的影响，结果的重复性较差。改变引物的结合位点，或者在扩增范围内有突变都会导致单个位点上扩增产物的有或无。这就意味着RAPD技术所提供的只是一种显性标记，它不能区分从一个位点扩增的DNA片断是纯合的（双拷贝）还是杂合的（单拷贝）。

微卫星又名简单重复序列或短串联重复序列，指以2～6碱基为核心序列，串联重复排列而成。由于核心序列的拷贝数不同而呈现高度多态性，广泛随机地分布于真核生物基因组中，在DNA序列中平均每6千碱基就可能出现一个微卫星座位。微卫星DNA分布广泛，高度多态性，呈共显性，易于自动化分析，是一种理想的分子标记。因此在制作DNA指纹图，鉴定亲缘关系，遗传图谱构建，数量性状座位定位，畜禽标记辅助选择和遗传多样性评估等领域有广泛的应用。随着PCR技术及凝胶检测方法的不断发展和更新，微卫星DNA标记越来越受到研究者的青睐，并发展成为继RFLPs标记之后的第二代分子标记。

3.基于PCR与限制性酶切技术相结合的DNA标记。这类标记是以限制性酶切和PCR技术为基础，将两种技术有机结合的DNA标记，主要包括两种：一种是先将样品DNA用限制性内切酶进行酶切，再对其酶切片断有选择地进行扩增，然后检测其多态性，这种标记称为AFLPs标记。另一种是先对样品DNA进行特异性扩增，再用限制性内切酶对扩增产物进行酶切检测其多态性，称为CAPS标记。

AFLPs是Zabeau等（1993）发明的一项DNA指纹技术，其原理是通过基因组DNA酶切片断的选择性扩增来检测DNA酶切片断的多态性。它是在RFLPs标记和RAPD标记的基础上发展起来的，既有RFLPs标记的可靠性，又有RAPD标记的方便性。AFLPs标记所需DNA量少，不需Southern杂交，实验结果稳定可靠，重复性强，呈现典型的孟德尔遗传，每个AFLPs反应可以检测的位点多达50～100个，多态性强，非常适合遗传多样性的分析。利用AFLPs进行畜禽的遗传变异研究和构建基因组图谱是十分理想的，不过AFLPs技术需要同位素进行检测，费用较高，而且对技术人员要求也高，所以也有其不足之处。

4.基于单核苷酸多态性的DNA标记。研究DNA水平上多态性的方法很多，其中最彻底最精确的方法就是直接测定某特定区域的核苷酸序列并将其相关基因组中对应区域的核苷酸序列进行比较，由此可以检测出单个核苷酸的差异。SNPs正是基于这个基础发展起来的。

SNPs是指基因组中单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性，包括碱基的转换、颠换、插入及缺失等形式。在动物基因组中平均每300～500个碱基对中即可发现1个SNPs。在家畜基因组中，SNPs位点同样存在。因此可在较小的DNA区段构建包括多个SNPs的单倍型，构建的单倍型所呈现的等位基因数最大值为2n（n为所含SNPs座位数），从而克服了单个SNPs标记信息含量不足的缺陷。SNPs具有高密度，分布广，多态信息含量大，易于检测和统计分析等优点，能较好用于基因图谱和数量性状基因座（QTL）定位研究，被誉为继第二代分子标记微卫星标记之后的第三代分子标记，已经在人的基因定位和人类疾病相关基因及药物设计研究中得到了广泛的应用，相信在动物基因组测序的基础上SNPs具有广阔的应用前景。

三、DNA分子遗传标记的未来

从传统的遗传标记到现代DNA分子遗传标记的发展过程，伴随着人们对遗传物质的基础DNA认识的不断深化，而遗传学理论上任何可能的技术突破都为动物育种新技术的产生提供了契机，通过将现代分子遗传学与数量遗传学结合产生的分子数量遗传学也将为进一步提高选种的准确性和前瞻性贡献力量。然而，不可否认的是，我们依然基本上还是处在常规育种的时代，传统的杂交育种理论依然是育种的主要理论基础，分子育种的技术体系还需要不断深化和完善。而且，通过分子标记辅助选择理论指导的分子育种技术（即各种遗传标记的检测技术）还需要在操作的简便性、成本、安全性等方面进一步完善，也只有这样才能在动物育种实践中实现其深远的影响。