枯草芽孢杆菌产酶活性改良研究进展

和小黑，张文举，魏晓燕

（石河子大学动物科技学院，新疆石河子 832000）

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是当今酶生产中应用最广泛的菌种之一，据不完全统计，枯草芽孢杆菌所产的酶占整个酶市场的50%。由于枯草芽孢杆菌具有产酶量高、种类多、安全性好和环保等优点，其在现代酶制剂生产中被广泛应用。枯草芽孢杆菌发酵生产的酶类已经在饲料、食品、纺织等领域发挥着重要的作用。一般自然界中存在的野生型菌株产酶量普遍较低，且酶的稳定性较差，如何提高菌株的产酶性能是普遍关心问题。因而培育、诱变、基因工程等技术不断地被研究者们用来尝试提高菌株的产酶性能。

1 枯草芽孢杆菌所产酶类

枯草芽孢杆菌是一类广泛分布于不同生活环境中的革兰氏阳性杆状好氧型细菌，在土壤和植物的表面普遍存在。菌体在生长过程中能产生多种活性物质，其中就包括多种酶类。研究表明，枯草芽孢杆菌能分泌植酸酶、蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶等十几种酶类（David等，1997）。这些活性酶能降解植物饲料中非淀粉多糖和大分子蛋白，提高饲料中营养成分的消化利用率，还可以补充动物内源酶的不足，从而促进动物的生长、提高生产性能（王振华，2008）。

2 枯草芽孢杆菌产酶活性改良法

2.1 微生物培养法

2.1.1 液体发酵条件改良法 枯草芽孢杆菌的生长环境会严重影响其产酶性能。培养基中的营养成分能改善枯草芽孢杆菌的生长状态，调控细胞内特定的代谢途径，从而提高酶的产量和活性。其中碳源和氮源对菌株产酶活性的影响最大，选择合适的碳源和氮源也显得尤为重要。常见作为碳源的物质有葡萄糖、淀粉、蔗糖等，常见的氮源有尿素、豆粉、蛋白胨等。同时发酵温度、接种量、初始pH值、发酵时间等也对其产酶性能有较大影响。全桂静和尹黎献（2011）对选育的高产低温碱性蛋白酶枯草芽孢杆菌发酵条件进行了优化研究，发现发酵条件为葡萄糖5 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母粉 3 g/L，pH 8.0，接种量 5%，装液量 20 mL（50 mL三角瓶），30℃发酵28 h时，酶活力最高，达2231 U/mL。Irfan等（2012）对产木聚糖酶枯草芽孢杆菌BS05深层发酵进行研究，发现静置发酵时，使用底物为米糠，碳源为蔗糖，氮源为酵母膏，发酵温度为37℃，发酵72 h时木聚糖酶活力最高，达到408 U/mL；在搅拌发酵时以甘蔗渣为底物在同样培养基条件下，转速为140 r/min，37℃发酵48 h，木聚糖酶活力最高，达439 U/mL。此外，研究者分别对枯草芽孢杆菌产中性蛋白酶（黄璠和蔡俊，2012）、淀粉酶（Poddar等，2012）、纤溶酶 （陈桂光等，2012）、 植酸酶 （Kammoun等，2012）、β-半乳糖苷酶（崔福绵等，1999）、纤维素酶（Deka等，2011）等的发酵条件进行优化均能不同程度地提高酶活性。

2.1.2 固体发酵条件改良法 固态发酵培养基质简单且来源广泛，多为便宜的天然基质或工农业副、废产品，如麸皮、薯粉、棉粕、大豆饼粉、高粱、玉米粉等，经发酵后不仅可以增加产酶量，还可以消除部分抗营养因子、改善蛋白质品质等，从而提高饲料的利用率。由于固体发酵过程中无废水、废气产生，与液体发酵相比减少了脱水、干燥等能源的大量耗费，故污染少、能耗低、技术较简单，因而得到广泛的应用（Elbendary，2006）。固体发酵产酶活性的大小主要受发酵底物、底物初水分、接种量、发酵温度、发酵时间、初始pH值等因素的影响。许多研究表明，对枯草芽孢杆菌的固体发酵条件进行改良也可以提高枯草芽孢杆菌酶的活性。Khandeparker等（2011）用海洋细菌枯草芽孢杆菌cho40发酵麦麸，研究发现在pH 6.0、发酵温度60℃时，木聚糖酶的活性达到最高。吴晖等（2008）研究了枯草芽孢杆菌固态发酵豆粕的不同发酵条件对发酵豆粕中蛋白酶活力的影响，结果表明在料水比1∶1 （V/V）、pH 7.0、 接种量 4%、30 ℃发酵 72 h条件下发酵豆粕，底物中蛋白酶活力最高，达到630 U/g。董绪燕等（2008）采用LB培养基活化的枯草芽孢杆菌发酵菜籽饼，发酵初始pH 7.0，发酵时间24 h条件下得到的溶栓酶其活性提高到83.32 U/g。 Huzairy 和 Khairiah（2012）分别以油棕榈壳和稻秸为底物，比较发酵后枯草芽孢杆菌产α-淀粉酶的活力，并对其发酵温度、发酵时间进行优化，结果表明以稻秸为底物发酵产α-淀粉酶活力高于油棕榈壳，达到276 U/g。Unakal等（2012）用产α-淀粉酶枯草芽孢杆菌发酵香蕉皮，对发酵时间、温度、pH值进行优化，α-淀粉酶的活力提高到7.93 U/mL·min。

2.2 枯草芽孢杆菌菌株基因改造法

2.2.1 诱变育种 随着对遗传变异现象认识的深入，出现了通过诱变剂提高诱变频率的育种技术。诱变育种技术是通过物理、化学技术人为地使其遗传物质发生变异，从中选育高产菌株。该技术具有操作简便、速度快、收效大等优点，而且诱变手段多样，所以是实验室及生产上最为常用的高产菌株的育种方式。常见的诱变方法有：激光、X-射线、Y-射线快中子、紫外线（UV）、亚硝基胍（NTG）和甲基磺酸乙酯（EMS）等。利用诱变的方法提高枯草芽孢杆菌的产酶性能，国内外已经有不少成功的报道。在化学诱变方面，孙金凤等（2008）研究表明，经硫酸二乙酯（DES）诱变处理 50 min后，筛选得到的枯草芽孢杆菌突变株 DES-4其壳聚糖酶活是原菌株的 2.7倍。Chand等（2004）用溴乙锭和NTG复合诱变，选育出突变菌株CMV5-A10，其滤纸酶活、羧甲基纤维素（CMC）酶活分别是野生菌的2.2和2.1倍。在物理诱变方面，谢凤行等（2009）采用紫外诱变的方法对枯草芽孢杆菌H4和H5进行连续诱变筛选产淀粉酶高的突变株。结果发现，第一次诱变后突变株的酶活分别为原始菌株的107%和111%；经过第二次诱变后，H4的突变株H4Ⅱa，H5的突变株H5Ⅱa和H5Ⅱb的产酶能力有很大程度的提高，分别为原始菌株的147%、136%和135%，说明紫外连续诱变有利于突变株产酶能力的提高。宋鹏等（2011）以产复合酶枯草芽孢杆菌QLB6为出发菌株，利用氦-氖（He-Ne）激光进行诱变育种，获得1株编号为QLB6F的菌株，其纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶酶活力较出发菌株分别提高219%、38%和71%。

目前也有学者将化学诱变与物理诱变相结合，也得到良好的效果。李然等（2008）从小麦根际土壤中分离到一株对多种植物病原真菌有拮抗作用且产蛋白酶的枯草芽孢杆菌T2，经UV和DES诱变处理，获得具有良好遗传稳定性的蛋白酶正负突变株。与出发菌株相比，培养48 h的正突变株胞外蛋白酶活力提高108.5%，负突变株蛋白酶活力降低81.1%。Zhang（2012）通过UV和亚硝酸钠溶液复合诱变枯草芽孢杆菌，突变菌株经发酵后角蛋白酶活力提高了75.9%。

2.2.2 基因工程法 随着现代分子生物技术的飞速发展，基因工程为菌种产酶性能改良开辟了一条新途径。该方法主要是对菌株的产酶基因进行改造，从而改善其产酶活性，是提高枯草芽孢杆菌产酶性能的一种便捷、有效的方法。它实现了超远缘杂交，是一种最新最有前途的育种方法。

目前，在国内外通过基因工程方法来提高产酶性能已经有许多成功的例子。马磊等（2005）用枯草杆菌强启动子P43构建了大肠杆菌-枯草杆菌穿梭表达载体pYG43，利用这种载体表达枯草杆菌纤维素酶产量比原宿主菌（B.subtilis1A747）提高了5～7倍。Kim等（2000）利用DNA改组融合技术，在大肠杆菌中表达使得枯草杆菌内切酶突变体的活性提高5倍。Liu等 （2012）将枯草芽孢杆菌TCCC11286的碱性果胶酶基因进行克隆，将果胶酶基因插入表达载体pWB980构成重组质粒pWB-Apel，然后将该重组质粒导入枯草芽孢杆菌WB600，在50℃、pH 9.0时经摇床发酵后酶的活力高达445 U/mg。Guan等（2013）将枯草芽孢杆菌X1漆酶基因进行克隆并在大肠杆菌中进行表达，研究发现漆酶在碱性和高温条件下仍具有较好酶活力。

2.3 添加化学因子的方法

2.3.1 金属离子对产酶活性的影响 枯草芽孢杆菌所产酶的活性也受到一些金属离子的影响。金属离子能以不同的方式与底物、酶的活性产物和酶本身产生极强的亲和力，从而导致酶活性的改变。有些离子能对酶活性产生抑制作用，有些则激发酶的催化功能。因而在培养基中适量添加一定浓度的具有激活酶催化作用的金属离子，如Ca2+、Mg2+、Na+、K+等，能够一定程度地提高枯草芽孢杆菌酶的活性。

2.3.2 非离子表面活性剂对产酶活性的影响 研究表明，非离子表面活性剂能够提高酶的活性及稳定性，其主要原因可能是因为这些分子提高了酶对营养物质的结合性，从而提高催化效果。目前对非离子表面活性剂的应用很多，然而促进枯草芽孢杆菌酶活性的报道较少。Poddar等（2012）对产耐高温β-淀粉酶枯草芽孢杆菌DJ5的产酶条件进行研究，发现在培养基中添加0.03%的赖氨酸能够显著的提高β-淀粉酶的活力。Evan和Abdullahi（2012）研究表明，在产蛋白酶枯草芽孢杆菌培养基中添加吐温-80，可以使蛋白酶的活力提高5倍，同时也提高了蛋白酶的热稳定性。

3 枯草芽孢杆菌产酶活性改良方法的优缺点

枯草芽孢杆菌产酶性能改良技术目前已取得了令人瞩目的成就，但其发展过程中仍存在不少问题。通过培养条件改良法来提高酶活力虽有效，但仅改善了枯草芽孢杆菌生长的外部环境，菌株本身的产酶能力并没有改善，因而提高能力有限。诱变育种方法尽管可以获得酶活性较高的突变株，但其稳定性较差，并且诱变后可能会出现正、负突变，有很大的盲目性，而且基因变异的程度也有限，进一步提高酶活性受到了限制。所以要获得酶活性提高很大的突变株，仍需进行大量的诱变筛选工作，才有望获得更为理想的稳定的突变株 （潘风光等，2005）。基因工程技术是目前最有效的提高产酶性能的方法，具有目的性和直接性。但其操作复杂，技术还不够成熟，目前仍处于探索阶段。向培养基中添加金属离子或表面活性剂能显著提高枯草芽孢杆菌产酶活性，操作简便，效果显著。然而其作用机理尚未明确，仍需要进一步研究。

4 展望

目前，枯草芽孢杆菌酶已是酶市场的主体，如何快速、有效地提高产酶的活性，以满足市场的需求，是亟待解决的问题。虽然目前对枯草芽孢杆菌产酶活性的改良技术已取得一定的成绩，但效果并不理想，而且技术方面也存在着许多问题。相信随着科技的发展，基因工程、现代分子生物技术的进步，有望筛选出更高产酶活性的枯草芽孢杆菌菌株，同时随着酶制剂在各领域的广泛应用，低成本、大规模的酶生产将成为今后酶工业发展的趋势，因此，酶制剂的开发具有广阔的市场前景和应用价值。

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