中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)的研究进展

阮红梅，张健之

中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East Respiratory Syndrome-Coronavirus, MERS-CoV)是2012年9月在沙特阿拉伯首次发现的一种新型高致病性冠状病毒[1]。冠状病毒能感染人及多种动物，并可导致人罹患从普通感冒到严重的急性呼吸综合征等疾病。MERS-CoV感染可引起严重的呼吸道疾病，其症状包括发烧、咳嗽及呼吸急促，并伴有较高比率的急性肾衰竭和死亡[1-2]。因其临床症状和2003年爆发的SARS-CoV很相似，故初期曾将其称为“类SARS病毒”。该病毒主要在中东地区流行，但目前在欧洲、亚洲和北美等地均先后出现感染病例及传播，且病例均和中东有直接或间接的联系，如来自中东或有过中东旅行史等。截至2014年6月26日，世界卫生组织(WHO)累计统计结果显示全球感染病例已达707例，其中252例死亡，死亡率约为36%[3],高于SARS病毒流行期间10%的致死率。目前对其感染尚无特效疗法，也无有效的预防疫苗。初步的流行病学研究表明，MERS-CoV是由动物传染给人，然后通过和被感染者的密切接触而在人与人之间传播。2014年以来在美国确诊的病例对MERS-CoV有可能造成全球流行的趋势再次引起了世界各国的重视和担忧。本文主要对MERS-CoV的结构分类、传播源及途径、致病机理、临床特点、诊断治疗、抗病毒药物和疫苗研发等作一综述，以便能引起人们对该病毒有一定的了解和认识，这对实施有效的预防控制及尽快开发出特异的抗病毒药物及疫苗提供重要参考。

1 命名、结构和分类

在初期报道中，MERS-CoV被称为Human Coronavirus Erasmus Medical Center/2012 (HCoV-EMC/2012)、新型冠状病毒(Novel Coronavirus , nCoV)、类SARS病毒、或沙特SARS等。为了便于相互交流及报道，2013年5月15日，国际病毒分类委员会冠状病毒研究小组决定将此新型冠状病毒统一命名为Middle East Respiratory Syndrome-Coronavirus，即MERS-CoV[4]。和其它冠状病毒类似，MERS-CoV形态结构为圆形或卵圆形，病毒颗粒直径大约60-220 nm，核心为单股正链RNA, 病毒的衣壳外面包含有糖蛋白组成的刺突样的结构，因其覆盖表面而使得整个病毒粒子在电镜下如皇冠样的形状, 因而得名冠状病毒。冠状病毒科主要有α、β、γ和δ四种类型，其中β属冠状病毒又分为A、B、C和D四个谱系[5]。迄今，有6个冠状病毒能引起人类疾病，包括：α类CoV-220E及CoV-NL63;β类A谱系CoV-OC43和CoV-HKU1、B谱系SARS-CoV；及当前的MERS-CoV。对MERS-CoV遗传及系统进化分析结果显示，它属于β类冠状病毒属C谱系的一个新种[6-7]。和SARS-CoV相比，MERS-CoV和同属β类C谱系的扁颅蝠冠状病毒HKU4和伏翼蝙蝠冠状病毒HKU5的亲缘关系更为相近[6-7]。MERS-CoV全基因组大小约为30.1 Kb ，至少包含有10个开放阅读框(Open reading frame, ORF)，分别编码一个大的复制酶多聚蛋白(ORF1a/ORF1b)、表面刺突糖蛋白(Spike, S)、小包膜蛋白(Envelope, E)、外膜蛋白(Membrane, M)、核衣壳蛋白(Nucleocapsid, N)、及5个非结构蛋白(ORF 3、4a、4b、5 and 8b)等[6]。其中由ORF1a/ORF1b编码的复制酶多聚蛋白包含两个多聚蛋白PP1a和PP1ab, 然后由蛋白酶剪切为15或16个非结构蛋白(Nonstructural protein, NSP)产物NSP1-NSP16，而NSP12即为RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase, RdRp)[6]。

2 传播源及传播途径

自发现MERS-CoV病毒以来，研究人员对其传播源进行多方面的调查及研究。最初，病毒学家Ron Fouchier推测这种病毒可能来源于蝙蝠，因为蝙蝠体内携带有多种类型的冠状病毒[8]。遗传及系统进化分析结果也显示MERS-CoV在亲缘关系上更接近于亚洲、欧洲、南非、加纳等蝙蝠体内的冠状病毒，尤其是和扁颅蝠冠状病毒HKU4和伏翼蝙蝠冠状病毒HKU5最为接近[2,6,7]。从沙特的一只蝙蝠粪便内检测到病毒RNA RdRp基因的一段包含190个核苷酸序列和附近患者体内分离到的MERS-CoV序列完全相同[9]。但该研究样本数太少，而且蝙蝠与人类的接触十分有限，因此专家推测，在蝙蝠和人之间可能还有另一中间宿主作为连接放大器，能使病毒在其体内大量扩增，使之更易于传播给人。

研究人员对中东地区的其它动物也进行了研究。Reusken CB等[10]在来自中东阿曼的全部50头单峰骆驼(100%)和西班牙加那利群岛105头骆驼中的15头(14%)的血清样本中检测到抗MERS-CoV刺突蛋白的特异性抗体，但在骆驼的血液及粪便中并没有检测到病毒的核酸，而在当地养殖的绵羊、山羊、牛，及北欧单驼峰的血清样本中未检出抗MERS-CoV刺突蛋白的特异性抗体[10]。Hemida MG等[11]对沙特阿拉伯两个区的单峰驼及其它家畜的研究也获得相似的结果，大部分单峰驼血清内抗体阳性，绵羊、山羊、牛及鸡的血清内抗体阴性。2014 年Hemida MG等[12]研究了在骆驼体内分离到的MERS-CoV，发现 且全基因组序列和人体内分离到的病毒序列具有99.9% 的相似性，只在S蛋白基因的受体结合域(receptor binding domain, RBD)之外发现6个核苷酸突变，但并不影响和细胞表面受体的结合Hemida MG等[12]还在骆驼的鼻拭子样品及粪便内检测到病毒，且鼻拭子样品内的病毒检测率更高。初步研究还发现，骆驼体内的MERS-CoV预存抗体并不能有效保护动物免受感染[12]。从沙特全国范围内采集的200 多头单峰驼血液样本中，也发现74%的样本显示血清抗体阳性；进一步的病毒核酸检测发现，病毒主要存在于骆驼的呼吸道中，部分粪便样品中也能检测到病毒核酸[13]。对1992 年至2010 年间采集的骆驼血液样本的分析表明，这种病毒在骆驼中存在的历史至少可追溯到1992 年，但骆驼没有表现出任何感染症状[13]。另外，研究人员也从骆驼的乳汁中发现了MERS-CoV，同时还在骆驼养殖场及屠宰场的工人中，发现8.7% 的工人体内含有抗MERS-病毒的抗体，说明他们可能曾经被MERS-CoV感染过，但并没有表现出严重的症状[14]。来自美国国家过敏与感染疾病研究所(NIAID)的研究人员也发现，在未消毒的骆驼奶中，MERS-CoV在4 ℃可以存活72 h，22 ℃时存活48 h，63 ℃加热30 min则未检测到活性病毒[15]。因为有些病例有骆驼接触史，且骆驼肉和奶都是当地的日常消耗品，所以研究人员认为骆驼是人类感染MERS-CoV的真正源头，但这些研究仍然不能确定病毒如通过何种途径传播给人的，也不能提供直接的证据。

最近的一篇研究报告则为该病毒是从骆驼传染给人提供了一个直接的证据[16]。该研究报告了2013年11月死于MERS-CoV的一名44岁沙特男子的研究结果。研究发现这名男子饲养有9头骆驼，其中4头骆驼生病流鼻水，病人曾在发病前为一头患病骆驼的鼻子抹药治疗，7天之后这名男子就患上了MERS。研究人员对从病骆驼中发现的病毒和致该男子死亡的病毒进行了比对，发现它们的基因组是一致的。因此，研究人员相信，这一MERS-CoV的致死病例是因为与患病骆驼密切接触而被传染所致。虽然骆驼有很大可能是MERS-CoV感染人类的主要来源，但对具体的传播途径仍不十分清楚。鉴于MERS-CoV在中东地区仍持续发生，2014年4月24日，WHO呼吁赴沙乌地阿拉伯、阿拉伯联合大公国等中东地区旅游者，应注意个人卫生及手部清洁，于人潮密集或空气不流通处可配戴口罩，并避免骑乘或接触骆驼，以降低受感染的可能性[17]。

Cotton等对阿拉伯的21个MERS-CoV病例的遗传序列进行了比较和分析，结果显示了病毒的遗传多样性，说明病毒可能是从多个点的动物源传播给人，随后在人与人之间传播[18]。集群性的传播感染多出现在家庭成员、病人与医护人员之间，尤其是医护人员的防护措施不到位的时候[19-21]。MERS-CoV潜伏期通常是5天，但最长的可达14天[19-20]。到目前为止，这种集群感染还较有限，没有扩大到社区范围内，且二次传播病例多显示无症状或症状温和[21]。另外，两个研究组通过对确诊病例的基本再生系数(R0)的研究分析显示，MERS-CoV目前还没有普遍流行的潜能[22,23]。

3 致病机理

MERS-CoV能感染多种细胞，它是利用表面S蛋白和细胞相互作用而进入靶向细胞。在病毒感染过程中，S蛋白能诱导产生中和抗体、T细胞免疫应答及保护性免疫。S蛋白是一型跨膜蛋白，包含两个功能性的亚基：位于膜外N末端的S1亚基和近膜端的S2亚基，S1决定细胞的极性和与靶细胞相互作用，S2则介导病毒囊膜与细胞膜融合。对几种人类冠状病毒的S蛋白的序列和模型分析显示，MERS-CoV的S蛋白具有一个受体结合域(RBD)[24]。由于MERS-CoV 和SARS-CoV有很高的临床相似性，所以初期认为MERS-CoV也和SARS-CoV一样，使用血管收缩素转化酶2 (angiotensin converting enzyme 2, ACE2)为细胞受体, 但随后的研究发现ACE2重组抗体的中和作用并不能阻止MERS-CoV 的感染[25]。进一步的研究发现二肽基肽酶-4 (dipeptyl peptidase 4,DPP4，亦称为CD26)能特异性地和MERS-CoV的受体结合S1域纯化出来，且DPP4在非敏感细胞内重组表达能使之变成易感细胞，DDP4的抗体能阻断病毒的感染，说明DPP4是MERS-CoV的功能受体[26]。在人体细胞内，DDP4在哺乳动物中高度保守，主要表达于肺肾肝小肠胰腺等上皮细胞表面及激活的淋巴细胞表面[27]。MERS-CoV通过其S蛋白上的RBD与细胞表面受体DPP4相互作用，介导病毒吸附于细胞，随之与细胞的膜融合及进入到细胞内，启动病毒感染。我国的研究人员从分子水平研究了MERS-CoV RBD与DPP4的结合与相互作用，以及所形成的复合物晶体结构[28,29]。研究结果均显示MERS-CoV RBD是由一个核心亚区和一个外部的受体结合亚区组成，且核心亚结构域与SARS-CoV刺突分子高度同源，但外部亚结构域则具有高度变异性，这种变异可能有利于实现病毒的特异性致病过程，如受体识别。进一步的突变研究还确定了RBD的几个关键残基，对病毒结合DPP4以及进入靶细胞至关重要。这些病毒与受体相互作用的分子水平研究，能为开发新型的治疗药物及疫苗提供非常重要的参考。

4 临床症状

WHO的MERS-CoV研究团队[2]对感染病例的研究显示，临床症状开始通常表现为发热、咳嗽、畏寒，喉咙、肌肉及关节痛，随之呼吸困难，然后迅速发展为肺炎，通常需要机械通气辅助呼吸及其它内脏器官保护治疗。严重者很快在肺炎基础上迅速发展为呼吸衰竭、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，肾脏衰竭等甚至危及生命。其中大约50%的病人发展成肺炎，超过10%的病人发展为ARDS，约1/3的病人显示出现胃肠道症状，如呕吐、腹泻。免疫抑制病人临床症状不典型，初期可仅表现为发热、腹痛和腹泻至后期的肺炎。大多数感染患者存在临床合并症，且具有慢性疾病或免疫力低的人群很易被感染，并有较高的几率发展为严重后果及死亡。

胸部X光片的结果和局限性肺炎和ARDS的结果一致，如双侧肺门浸润，单侧或双侧片状增厚、分割或肺叶混浊，毛玻璃样外观，胸膜积液等。下部肺叶比上部肺叶受损程度更大。CT扫描则显示间质性浸润和实病。患者通常表现为白细胞减少，尤其是淋巴球减少症。另外患者的血、尿及粪便中均能能检测到病毒RNA，但远少于呼吸道内的病毒量，且上呼吸道中的病毒量通常也比下呼吸道量少。在一些病患中发现有其它呼吸道病毒共感染，在机械通气的病患中也出现医院获得性细菌感染。

WHO于2013年7月3日更新MERS-CoV感染的诊断标准疑似病例需满足以下3条标准：具有发热性的急性呼吸道感染，且临床、影像学或组织病理学证实存在肺实质疾病(如肺炎或ARDS)；实验室检测结果不确定；与确诊患者有密切接触[30]。确诊病例则需要MERS-CoV实验室检测阳性。

5 实验室检测

细胞培养检测MERS-CoV仍为实验室检测的金标准，但常规不推荐此法。目前，MERS-CoV主要是通过实时定量逆转录PCR(Real-time RT-PCR，rRT-PCR)的方法，对呼吸道、血液和粪便样品进行病毒核酸的检测。目前rRT-PCR主要检测病毒的三个基因序列[31-33]：E蛋白上游基因(upE)，ORF 1b基因和，ORF1a基因。upE基因序列检测高度敏感性，适用于对MERS-CoV样品的筛选检测；ORF 1b基因和upE基因序列检测具有同等的敏感性；ORF1a基因检测，敏感性比前二者低，但特异性更高。另外，在MERS-CoV的基因组序列中位于RdRp 和N基因内有两个适于验证的靶序列[33]。美国疾病控制及预防中心(CDC)目前采用靶向病毒核衣壳蛋白(N)基因及upE的rRT-PCR进行样品筛选检测，然后再用另一靶向N基因的引物对单一或双阳性PCR结果进行进一步验证[34]。确认的阳性结果需满足两个条件：有两种特异性PCR靶向扩增结果呈阳性；或者一种PCR结果阳性，另一种PCR产物序列测定结果与已知序列相符合。检测时要尽量排除各种原因(如样品质量差，病毒基因突变等)造成的假阴性结果。当PCR检测为阴性，但患者具有MERS-CoV感染的临床症状或流行病学特点时，可用血清学方法进行检测。其它的检测方法也在研究之中。

6 临床治疗

自SARS后，感染控制、分子诊断及国际公共卫生等都有了很大的改善，但目前对冠状病毒的治疗，仍然没有特异性药物及疫苗，因此对MERS-CoV感染病人的治疗主要是对内脏器官支持与保护，缓解病人的症状，并降低并发症的出现[2,35]。例如对ARDS患者实施肺保护性通气策略，心血管的支持及保护，使用广谱抗菌素降低机会病原的共感染，对急性肾衰竭患者采用肾脏替代治疗，实施外膜肺氧和(ECMO)等。目前，已有一些治疗MERS-CoV可能的选择方案，但大多是从治疗SARS和流感等的临床经验而来的，如使用恢复期的血清、干扰素(Interferon，IFN)、利巴韦林(Ribavirin)、皮质类固醇(Corticosteroids)等[35-36]。有的医院对一些病情严重的患者采用了高剂量的皮质类固醇来治疗，目的是为了阻止呼吸窘迫的发展并防治肺部纤维化，但治疗效果并不成功，同时还可能由于其它原因造成治疗不当。从治疗SARS及H1N1的结果来看，这种疗法也被证明是有害而无益。因此WHO并不推荐用此法来治疗MERS-CoV感染，除非患者有哮喘或升压顽固性休克[2]。在治疗过程中，还需对病人实施密切监测、有效的隔离和必要的防护措施。

7 抗病毒药物及疫苗的研发

当前，各国学者都在寻找抗MERS-CoV的有效药物，由于新药物的研发时间较为漫长，研究人员正试图从现有的药物来筛选，以尽快解决当前的迫切需要。药物的选择主要基于几个方面：能阻断病毒的入侵及扩散、抑制病毒核酸复制及病毒蛋白合成、调节机体的抗病毒免疫和联合性治疗等，目前已有一些可喜的研究结果，为感染患者带来新的希望[36]。

康复期的血清来自于遭受过MERS-CoV感染但已经康复的病人，可能含有能中和病毒的抗体，因此是推荐治疗的首选[35-36]。目前已在一康复患者的血清内，检测到了高水平的抗MERS-CoV的抗体[35]。在德国两个MERS-CoV病人血清内也检测到特异性抗体的存在，其滴度达1∶640[37-38]。目前还没有使用该疗法对MERS病人的治疗数据，且可获得性非常受限，但它能证明中和细胞外病毒的方法是否是最佳疗法，同时也能促进抗体研究的发展。从以前治疗SARS的临床结果来看，可能有很多因素干扰了康复期血清的治疗，如病人的并存疾病及其程度、其它治疗药物的干扰等，导致治疗效果无法确定[39]。

选择能有效抑制MERS-CoV RBD和DPP4结合的药物也为治疗提供了新的希望。研究发现，DPP4的结合蛋白腺甙脱氨酶(Adenosine deaminase)能竞争性的拮抗病毒与受体的结合，从而抑制MERS-CoV的细胞感染[40]。抗DPP4的多克隆抗体在体外研究中显示有对MERS-CoV感染的抑制[26]。人源性的抗DPP4单克隆抗体(mAbYS110)能识别DPP4的6个不同的抗原决定簇，对MERS-CoV感染显示明显的抑制作用，是治疗MERS的一个很好的候选者[41]。最近，清华大学的研究团队[29]也分离到两株抗MERS-CoV RBD的具高效中和能力的单克隆抗体MERS-4和MERS-27，二者均可在纳摩尔浓度下，通过阻断RBD 和细胞表面受体DPP4的作用，进而特异性的抑制假型病毒和活性病毒的细胞感染。同时MERS-4和MERS-27还具有明显的相互协同作用，可以大大加强抗MERS-CoV及其在感染及传播过程中产生的变异病毒的效果，从而提高抗病毒的活性和广谱性。美国研究人员也筛选出7株抗MERS-CoV RBD特异性中和抗体，能特异结合刺突蛋白和DPP4结合界面的3个抗原决定簇，进而阻断病毒对细胞吸附；其中一株抗体3B11表现出了最高的中和活性，被认为最有医学应用潜力[42]。这些研究结果有望为病情严重的MERS-CoV感染者提供一条快速有效的特异性治疗途径。

病毒复制的抑制剂也是治疗MERS-CoV的可能药物。利巴韦林是抑制核苷类似物，能通过抑制RNA的复制而具有广谱的抗病毒活性[43]。环胞多肽A(Cyclosporin A)能有效抑制SARS-CoV、MERS-CoV等冠状病毒的在细胞内复制[44]。霉酚酸(Mycophenolic acid)是一种能抑制淋巴细胞增殖、阻止病毒RNA复制的免疫抑制剂，具有很强的体外抗MERS-CoV的活性[45]。当联合应用霉酚酸及IFN-β时，其EC50值较应用每个单药时低了1-3倍，因此也可考虑为MERS的实验性治疗方案[43,45]。冠状病毒在非结构蛋白基因14(nsp14)内表达3′到5′的核糖核酸外切酶(Exoribonuclease，ExoN)。最近的研究发现ExoN也可能是一个很好的抑制靶向，它的小分子抑制剂联合利巴韦林或RNA突变剂使用时可抑制冠状病毒的复制，因此可能成为一个潜在的治疗所有冠状病毒的方法[46]。洛匹那韦(Lopinavir)和利托那韦(Ritonavir)是蛋白抑制剂，在SARS治疗过程中，发现二者和利巴韦林联合使用时，比单独使用利巴韦林时，对病人的临床结果有明显改善作用[47]，这对MERS治疗也有借鉴作用。

机体的免疫调节也是发展抗MERS-CoV治疗药物另一方法。聚乙二醇化的IFN-α抑制MERS-CoV的效率是SARS-CoV的50-100倍[35]。相较于SARS-CoV，IFN-I(α，β)和IFN-III(λ)能更有效地降低MERS-CoV在人气道上皮细胞中的复制[48]。Hart等则比较了IFN-α2b、IFN-β、IFN-γ和IFN-α2a等的效应，结果显示IFN-β对MERS-CoV具有最强的抑制效应[45]。另一体外研究显示加入IFN-β后，导致明显的抗MERS-CoV效应，并能使病毒量降低3个指数级，至不可检测的水平[49]。这些结果均能为MERS治疗提供更多可能的选择。另外，从SARS-CoV的临床经验中，IFN被单独使用或联合利巴韦林使用[35]。

抗病毒治疗和免疫调节剂的联合治疗曾经是SARS治疗的一种模式。联合使用利巴韦林及干扰素-α2b，在较低的浓度下就能有效抑制MERS-CoV在培养细胞内的复制，且二者具有协同效应[50]。当用于处理MERS-CoV感染8 h的动物模型恒河猴后，也能降低病毒在体内的复制，改善临床结果，如肺部伤害显著减少[51]。由于利巴韦林和IFN-α2b这两种强抗病毒制剂已在临床上被广泛用于治疗丙肝，同时也是用于治疗SARS病人的一个方法，因此，研究专家建议把它们作为MERS的一种早期的介入疗法。不过，最近的一个临床观察结果显示，该联合疗法可能只对某些诊断早期的病人有效，而对具有严重感染并含多个并发症的晚期诊断患者并不产生治疗效果[52]。同时，施药的时间点也是影响治疗效果的一个重要因素。

另外，美国马里兰的研究人员[53]对290种已经在美国获批或正在后期临床试用的药物进行了筛选，发现有27种药物能有效对抗MERS-CoV和SARS-CoV的感染。这些有效的抗病毒药物包括抗癌、抗精神病或抗其它病毒的药物，如抗肿瘤药物甲磺酸伊马替尼(Imatinib mesylate)及达沙替尼(Dasatinib)，抗精神病药氯丙嗪(chlorpromazine)，抗线状病毒(Filoviruses)及肿瘤药物枸橼酸托瑞米芬(Toremifene citrate)，抗疟疾药物氯奎(chloroquine)等 。欧洲的研究人员[54]也用类似的方法筛选了348种FDA批准的和政府批准的药物，发现有四种药物能在相对较低的浓度下对抗MERS和SARS病毒，其中包括有在上述研究中得到证实的两种药物：氯喹和氯丙嗪。另有研究还发现，能有效抑制SARS-CoV繁殖的小分子抑制剂SSYA10-001，对MERS-CoV也有同样的抑制效果[55]。这种老药新用的方法，不仅能尽快解决当前需要，还可以给新药发展提供新的思路，大大缩短研发时间。

8 结束语

目前，对MERS-CoV还有很多的问题有待解决，如病源动物和人之间可能有哪些直接或间接的传播途径，人与人之间是否具有大规模传播的可能，传播过程中RNA病毒的突变及毒力的变化性，如何阻断病毒的传播及发展出有效的抗病毒药物及预防疫苗等。这就需要各国投入更多的调查及研究，以便尽快明确传播病源及传播途径，以便实施有效的预防及监控措施，并尽早研制出特异性的治疗药物及疫苗。

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