壳聚糖缓释微球疫苗佐剂研究进展

刘 岩，吕志强

（浙江省农业科学院蚕桑研究所,浙江杭州 310021）

壳聚糖缓释微球疫苗佐剂研究进展

刘 岩，吕志强

（浙江省农业科学院蚕桑研究所,浙江杭州 310021）

壳聚糖高分子材料具有良好的生物和理化特性,用其制备的微球疫苗是目前缓释疫苗佐剂的研究热点之一。微球佐剂能保护抗原、实现缓释作用,提高抗原利用度,促进机体免疫反应。本文围绕壳聚糖微球的研究和应用近况进行综述。

壳聚糖；微球；缓释；疫苗佐剂

佐剂是指能增强机体抗原免疫应答或改变免疫应答类型的物质。它主要通过免疫调节（细胞因子网络的修饰）、抗原递呈（抗原构象的维持）、细胞毒性T淋巴细胞（CTL）诱导、抗原靶向和储存等方式诱发机体产生长期、高效的免疫反应,提高机体保护能力,同时又减少免疫物质的用量,降低疫苗生产成本［1］。传统疫苗多为病原体或其裂解物,免疫原性强。但随着现代生物技术的发展,基因工程亚单位疫苗、合成肽疫苗、DNA疫苗等新型疫苗抗原的纯度越来越高,免疫原性却通常较弱,需要使用佐剂来提高对抗原的保护作用［2］。研究安全、高效、稳定的佐剂成为学者关注的焦点,而其中缓释微球包裹技术是近年来的研究热点。

缓释微球包裹技术开始于20世纪50年代,首先应用于药物释放系统的研究。直到1979年, Morris等［3］才首次将这项技术应用在免疫学研究,在制备微球疫苗免疫小鼠时发现,该系统可以持续释放抗原,刺激抗体产生,而不会诱发免疫耐受,微球佐剂也才开始引起人们极大的关注。微球佐剂作为抗原的一个稳定的隔离载体,发挥着保护抗原蛋白的作用,使抗原在体内免受温度、酸碱、渗透强度、消化液等因素的破坏,而且微球抗原还能避免母源抗体的中和作用,实现抗原可控制释放,产生相当于常规疫苗多次接种激发的免疫效果,从而延长疫苗免疫期,减少免疫次数。目前,常用的微球载体高分子材料主要有壳聚糖、透明质酸以及海藻酸钠等。其中,壳聚糖来源广泛、价格低廉,体内不积蓄,无抗原免疫性,生物相容性优良等特点,使其成为一种理想的疫苗佐剂载体［4］,本文围绕壳聚糖作为疫苗递呈佐剂的研究和应用情况进行综述。

1 壳聚糖的理化特征

壳聚糖是由葡糖胺和N-乙酰基葡糖胺组成的多糖,是甲壳素脱乙酰基的产物。壳聚糖广泛存在于蟹、虾等低等动物以及藻类、真菌等低等植物中,含量极其丰富,是仅次于纤维素的第2大多糖［5］。壳聚糖分子基团具有1个氨基和2个羟基, pKa值约6.5,带正电荷,不同脱乙酰度壳聚糖的分子量、黏度等有所不同。

壳聚糖主要来源于甲壳纲动物和真菌的菌丝体,以及蘑菇、藻类、酵母等。动物来源壳聚糖易受季节等波动,稳定性有不足之处［6］。菌菇来源的壳聚糖具有四季可控、稳定生产的优势,物理提取壳聚糖与生产培养的基质密切相关。从生物安全和保健角度考虑,菌菇源的壳聚糖更优于甲壳动物来源［7］。根据来源和制备方法的不同,壳聚糖脱乙酰度在60%～100%,分子量300～1 000 ku。低聚壳聚糖可通过特定的酶或试剂降解壳聚糖制备而得［8］。

壳聚糖理化特征很难预测,通常需要先制备产品,再进行组分和特征的鉴定。作为一种天然成分,不同批次、来源的壳聚糖混合的有机和无机杂质各有不同,所以一般生产商侧重介绍产品的黏度,而不是分子量；这也与壳聚糖仅溶于酸性溶液,很多项目的分析测试难以开展有关。壳聚糖的脱乙酰度常用pH电位滴定法,红外光谱,核磁共振谱,紫外光谱,胶体滴定法和酶法降解测定［9］,分子质量则常用黏度法或色谱法测定［5］。

2 壳聚糖作为生物材料的作用特征

壳聚糖的氨基葡萄糖残基带正电荷,可以与唾液中带负电荷的黏蛋白的糖蛋白结合,实现黏膜黏附作用。脱乙酰度越高,黏附作用越强,这也与壳聚糖脱乙酰后正电荷数量的增加,从而改进了黏膜黏附性能有关［10］。再者,由于壳聚糖带正电荷,可以与细胞膜负电荷相互作用,细胞间紧密连接被打开,增加了多聚物的渗透性。这种渗透能力也随着壳聚糖脱乙酰度的增加而增加［11］。

壳聚糖还具有抗菌活性,一种观点认为是带正电荷的壳聚糖可以与细胞表面负电基团相互作用后改变细胞通透性,阻碍重要物质进入细胞,和/或导致细胞必须生长物质的缺失。也有提出是细胞DNA与壳聚糖相（主要通过质子化氨基基团）结合,抑制了微生物RNA的合成［12］。此外,壳聚糖还具有抗凝血［13］、镇痛作用［14］。

壳聚糖富含易断裂的糖苷键,在体内可被多种蛋白酶降解,特别是溶菌酶［15-16］。壳聚糖聚合物的结晶度与生物降解动力学呈负相关关系。壳聚糖脱乙酰度下降至60%左右,结晶度降低而生物降解速率增加；同时,壳聚糖的乙酰基残基也会影响它的结晶度；壳聚糖糖链越短,越易被降解。降解后的壳聚糖生成无毒低聚糖,经代谢后排出体外。壳聚糖的降解速率主要与脱乙酰度有关,也与N-乙酰氨基葡萄糖残基的分布和壳聚糖分子量有关［17］。

鉴于壳聚糖所具有的良好生物降解性、降解产物无毒副作用、体内不积蓄、生物相容性优良等特点,美国食品药品管理局已批准壳聚糖用于伤口缝合线。这些特点也决定了壳聚糖在医药、免疫学等领域的重要应用价值。

3 壳聚糖递呈疫苗研究

壳聚糖微球聚合体可保护抗原免受外界不良因素（如有机溶剂,较低或较高的pH环境,蛋白酶等）的影响或破坏,为疫苗提供可靠的保障［18］。壳聚糖微球疫苗具有无毒、生物相容性和可降解性,可改变和控制抗原的释放,提高抗原生物利用度,以及增加抗原局部滞留性等优点［19］。

壳聚糖微球可以通过乳化交联［20］、喷雾干燥［21］、沉淀/凝聚［22］等方法制备。通过人为调控微孔大小可以控制抗原释放的速率。一次性注射后,抗原在机体内可连续缓释数周甚至数月,刺激机体产生持续高效抗体。

壳聚糖微球疫苗中的壳聚糖具有免疫佐剂功能和载体功能,可诱导小鼠脾细胞产生相当水平的IL2［23］,增加肠道淋巴细胞中IgA、IgG的水平［24］,激活补体、刺激巨噬细胞活化,增强吞噬能力,促进黏膜中抗原递呈细胞对抗原的摄取［25］。壳聚糖皮下接种可以增强体液、细胞免疫反应［26］和黏膜免疫［27-28］,具有良好的开发潜力。

3.1 壳聚糖微球佐剂

3.1.1 壳聚糖DNA微球疫苗

壳聚糖的正电荷通过与DNA的负电荷相互作用,使进入体内的重组质粒DNA被Peyer集合淋巴结的M细胞捕获,促进免疫反应的发生。壳聚糖DNA聚合物还可以保护DNA在生理盐水或乙酸溶液中免受核酸酶降解［29-30］；而且制备安全、储存稳定［31］。壳聚糖首次被用于递呈质粒是在Mumper等［32］的研究报道中,Tian等［33］将鱼淋巴囊肿病毒病的衣壳蛋白MCP基因的pDNA,通过乳化交联与壳聚糖形成微球,直径小于10μm。Soane等［34］研究发现,壳聚糖包封基因后,其半衰期由15 min延长到43 min。Rejesh Kumar等［35］制备壳聚糖包封弧菌DNA的微球疫苗能刺激石斑鱼产生对弧菌的中等抵抗力。

3.1.2 壳聚糖蛋白微球疫苗

壳聚糖包裹蛋白类疫苗时,其包封率和载药量均很高。Van der Lubben等［36］利用壳聚糖微囊包被,制备壳聚糖微球大小（4.3±0.7）μm,载药量超过40%。4 h内超过90%仍保存在微囊内。孙庆申等［37］通过吸附法制备载牛冠状病毒N蛋白壳聚糖微球,结果微球形态好、表面光滑、分散性较好,平均粒径为（6.50±1.77）μm,在体内具有一定的缓释作用。Sui等［38］用壳聚糖作为佐剂,将E.coli表达纯化的M1蛋白免疫BALB/c鼠（滴鼻）,结果显示壳聚糖蛋白混合物不仅能保护机体免受H9N2病毒的攻击,还能保护免受70%的H1N1和30%的H5N1病毒的攻击。

3.1.3 壳聚糖与疫苗联合使用

壳聚糖白喉、破伤风疫苗免疫,对体液和细胞免疫均有显著增强反应［39-40］。Rauw等［41］将新城疫疫苗与壳聚糖结合,免疫后将鸡处死,取脾脏研磨,用PMA刺激细胞后,发现脾淋巴细胞增殖活性明显增强,且IFNγ的表达量也大幅增加,外周的细胞免疫发生的时间更早、更强烈,而消化道内局部的细胞免疫相对弱一些,表明壳聚糖作为佐剂可诱导Th1型免疫反应,增强免疫效果。徐怀英等［20］利用壳聚糖为囊材制备新城疫微球疫苗,免疫试验证实有较强的细胞免疫和体液免疫［20］。常海艳等［42］将壳聚糖与疫苗混合经腹腔注射免疫BALB/c小鼠,间隔3周,免疫2次；免疫后取血清,检测血清中所产生的IgG,IgG1,IgG2a等抗体水平,同时取小鼠鼻洗液检测IgA抗体；加强免疫后1周,用致死量流感病毒AP/R/8/34（H1N1）攻击小鼠；结果表明壳聚糖作佐剂能显著增强血清抗体IgG1和IgG2a含量,并提高小鼠抗病毒攻击的能力,作为流感病毒灭活疫苗的新型佐剂,可以增强疫苗的抗体反应。谢勇等［43］研究表明,以壳聚糖为佐剂的幽门螺杆菌（Hp）疫苗对Hp感染具有免疫保护作用,并可成功诱导黏膜局部的特异性体液免疫应答,这可能在其免疫防御中起作用；而且可促进Thl和Th2的混合免疫反应,逆转Hp感染所致Th2反应的抑制、使Thl和Th2反应达到平衡,从而发挥其免疫保护作用。

3.2 壳聚糖复合缓释微球

由于壳聚糖本身的亲水性、酸溶胀性等特点,单纯壳聚糖形成球囊往往韧性差、降解快,作为药用辅料效果不是非常理想［44-45］,因此,将壳聚糖与其他生物材料共混来制备微球成为该领域的新趋势。

3.2.1 壳聚糖/海藻酸钠

海藻酸钠为天然高分子多糖,是一种阴离子型的共聚物,可生物降解,生物相容性好,并且具有一定的免疫佐剂作用。海藻酸钠易与二价阳离子交联固化,利用这一特性,可通过喷雾干燥和离子交联法制备海藻酸钠微球［46］。由于壳聚糖分子链上有大量的氨基,海藻酸钠分子链上有大量的羧基,所以壳聚糖和海藻酸钠可通过正、负电荷吸引形成聚电解质膜,从而提高微囊的稳定性和载药量,并可调节药物释放速度［47］。王毅超等［48］以壳聚糖、海藻酸钠为主要材料包裹Hp全菌超声蛋白抗原,制备新型Hp疫苗制剂,所制备的微球形态规则,平均粒径3.33μm,蛋白包封率约为64.8%,微球呈显著缓释模式,缓释时间可达6 d。Ma等［49］通过壳聚糖-海藻酸钠-CaCl2系统制备噬菌体Felix O1微囊,体外模拟胃液、胆汁盐环境,Felix O1在pH值低于3.7下5 min即被降解；相反,微囊包被组在pH值2.4胃酸条件下处理1 h,也仅仅降低2.58个对数单位；在1%和2%胆汁溶液中处理3 h分别降低1.29和1.67个对数单位；干燥微囊贮存6周后,噬菌体仍有12.6%的存活率,这为今后胃肠道免疫应用提供了方便。

3.2.2 壳聚糖/聚乙丙交酯

聚乙丙交酯（PLGA）是由乳酸（lactic acid, LA）与羟基乙酸（glycolic acid,GA）共聚合而成。降解时酯键发生水解,大分子链逐渐断裂成低分子聚合物,最终经GA、LA生成CO2和H2O等产物。PLGA有很好的稳定性和安全性,易于被吞噬细胞摄取,可通过在颗粒表面吸附相应的配体定位到特定的组织或器官。但PLGA微球包封药物突释现象明显,这与药物主要分布在微球表面有关。由于壳聚糖有效的缓冲作用,研究者制备PLGA/ CS复合微球可避免PLGA微球引起的pH值的下降,减轻微球突释现象［50］。Wang等［51］通过PLGA/CS形成复合微球,发现CS涂层是一种有效控制PLGA微球初始突发释放蛋白质的方法,也有助于克服了酸性蛋白加载PLGA微球,因此研究人员尝试通过涂层防止药物-聚合物过早分离。

3.2.3 壳聚糖/丝素蛋白复合微囊

丝素蛋白是家蚕幼虫产生的,由18种氨基酸组成,无毒、无刺激,具有良好的物理、化学、生物学性能,它没有免疫反应,具有良好的血液、组织相容性和抗凝血性。丝素蛋白胶凝冻结棚架评估微结构形态与扫描电子显微镜揭示相对均匀的孔结构和良好的互联互通性［52］。Yeo等［53］利用spray dryer方法制备丝素微球。丝素中含有丰富的酰胺基和少量羟基,丝素蛋白的羧基在pH值4.2以上带负电荷［54-55］,可与壳聚糖形成氢键,破坏壳聚糖链本身之间的复合凝聚,在共混膜方面已有研究报道［56］。Deveci等［57］利用复凝聚法制备丝素蛋白与壳聚糖的复合微囊,两者比例为5时能形成表面光滑的微球。比例大于14时,微球有2层结构,内层致密,外层多孔。刘纯等［58］以丝素蛋白、壳聚糖为载体材料,双氯芬酸钠为模型药物,制备微球并考察其性质及体外释放；载药微球平均粒径（26.54±1.39）μm,且大小在20～30μm的微球占总数的81.47%。释放时间可以持续200 h,缓释效果较单一的壳聚糖微球好。来水利等［59］以胰岛素为目标药物,以丝素（SF）和羟丙基壳聚糖（HPCS）为包药材料,用复凝聚法制备SF-HPCS载药微球；平均粒径22.4μm,48 h内释药率92.2%。Chung等［60］利用CS和SF在TPP作用下,采用spray-diried方法制备多孔微囊用于药物缓释。作者实验室利用壳聚糖、丝素蛋白2种材料,首次制备了荷载IBDV多聚蛋白基因的复合微囊,经动物试验对防治鸡传染性法氏囊病有较好的免疫效果,为疫苗佐剂的开发提供了新的参考。

此外,张灿等［61］将具有肝靶向作用的半乳糖和壳聚糖偶联,制备N-乳糖酰化壳聚糖,并对其性能进行了研究,认为该复合制剂有望成为新型的肝靶向药物载体。Sun等［62］报道,发现壳聚糖/脂质体包封质粒DNA后的拷贝数增加更明显。Zheng等［63］用海藻酸-壳聚糖共混后,再与PLGA制备3层复合微球,发现复合微球承载能力是常规PLGA微球的7倍多,复合微球疫苗诱导更强的免疫功能。

4 展望

壳聚糖具有特殊的生物、理化性质,是一种极有潜力的新型疫苗佐剂,近年来对它的研究取得了很大进展。但是从应用程度来讲,多数仍停留在实验室阶段。今后,如何改善壳聚糖亲水性、选择安全适合的改性材料、减少制备工艺对疫苗稳定性的影响、实现制备工艺的重现性和放大生产等等,这些问题都有待于进一步的研究解决。总之,随着微球佐剂研究的不断深入,以及相关学科技术的不断发展完善,可以相信在不久的将来,壳聚糖等微球疫苗佐剂必将在疫病防治中发挥重要的功效。

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（责任编辑：张才德）

S 88

A

0528-9017（2014）03-0416-05

文献著录格式：刘岩,吕志强.壳聚糖缓释微球疫苗佐剂研究进展［J］.浙江农业科学,2014（3）：416-420,424.

2013-12-09

浙江省自然科学基金（Y3110544）；浙江省农业科学院重点实验室开放课题

刘 岩（1976-）,女,河南焦作人,副研究员,博士,从事桑蚕基础研究工作。