弓形虫基因型鉴定方法的研究进展

钱伟锋，闫文朝，韩利方，王天奇

弓形虫是一种专性有核细胞内寄生的原虫，能够感染人和所有的温血动物，对人和动物的健康均存在严重的威胁。文献报道，世界上约有1/3的人呈慢性感染，弓形虫感染能够引起孕妇和怀孕动物的流产、胎儿畸形等；引起免疫抑制病人或动物的脑炎、急性弓形虫病等，严重时甚至导致死亡[1]。目前，已知弓形虫仅有一个种，但存在着不同的基因型。除典型的I型、II型和III型外，还有至少138个非典型基因型(www.toxodb.org)。世界范围内，弓形虫基因型的分布具有地域性[2]，国内有关弓形虫分型的研究相对较少。最初根据弓形虫对小鼠的致病力，将其分为高致病力(如I型)和低致病力(II型和III型)虫株[3]；后来，学者们逐渐发现了多个用于弓形虫基因型鉴定的遗传标记，并建立了多种基因型鉴定的方法，如多位点测序法、PCR-RFLPs、微卫星法等，随着研究的深入，这些方法被逐渐地发展和完善，对弓形虫的分子流行病学研究及弓形虫病的防控有着重要意义。为此，本文对弓形虫基因型的鉴定方法进行了总结，为更好地选择合适的分型方法等提供参考。

1 多位点测序分型法

多位点测序分型法(multilocus sequence typing，MLST)是建立在DNA序列多态性的基础之上，对扩增的DNA序列进行测序来检测序列内单核苷酸的多态性(SNPs)。SNPs是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A，G，C，T)替换而引起的多态性，它是一种单核苷酸的变异，SNPs被认为是一种能稳定遗传的早期突变，可用于群体遗传学中关于生物起源、进化和迁移等方面的研究。

SNPs是基因组中最常见、分布最广泛的DNA多态性类型。基因组中每1kb就有1个以上的SNPs，因此整个基因组中SNPs非常丰富。在基因组DNA中，任何碱基均有可能发生变异，因此SNP既有可能在基因序列内，也有可能在基因以外的非编码序列上。在弓形虫体内发现的SNPs有的位于编码虫体表面的抗原及细胞器抗原的基因内[4-5]；有的位于编码弓形虫结构蛋白的基因内，如α-微管蛋白、β-微管蛋白和肌动蛋白[6]；有的位于编码某些酶的基因内，如二氢叶酸还原酶和合成酶、胸腺嘧啶合成酶、DNA聚合酶α等[7-8]；还有一些位于未知功能的基因内，如850、950、L328、C19和B1基因等[9-10]。到目前为止，至少已发现250个SNPs生物学标记，核苷酸总长度达到300 kb，贯穿了弓形虫的14条染色体。这些标记已经被广泛应用于研究弓形虫的遗传多样性研究，并且对研究弓形虫的表型特点(如弓形虫毒力相关基因)等有很重要意义。该方法具有很高的分辨率和准确性，但是大量的扩增和测序需要有充足的样本，并且耗时，成本也比较高。

2 聚合酶链反应-限制性酶切片段长度多态性分析法

聚合酶链反应-限制性酶切片段长度多态性分析法(Polymerase Chain Reaction- Restriction Fragment Length Polymorphism，PCR-RFLP)也是检测DNA序列内单核苷酸的多态性(SNPs)，但只检测内切酶识别位点内的SNPs，该方法是对传统RFLP的一种改进。首先采用PCR技术扩增出一段特定的DNA序列，再用限制性内切酶酶切此段序列，经琼脂糖凝胶电泳后，通过片段长度的多态性来判读比对不同来源基因序列的差异性[10]。与测序方法相比，PCR-RFLP检测结果的信息含量比较少。例如，Fazaeli等通过测序弓形虫高多态性基因GRA6将弓形虫30个分离株分为9个组，通过PCR-RFLP的方法却只能够将其分为3个组[5]。尽管这样，PCR-RFLP仍然是目前用于弓形虫分型最为常用的的方法，因为通过该方法可方便、快速、大量地分析弓形虫的基因型特点。

最常用于弓形虫基因分型的特异性标记是SAG2基因，主要是通过对该基因的两个限制性酶切位点进行PCR-RFLP分析，基于该方法，Howe等首次将弓形虫划分为3个典型基因型I～III[11]。早期的很多研究完全依靠SAG2基因对弓形虫进行分型，但是仅用SAG2一个基因对弓形虫进行分型的能力是有限的，特别是对于重组的或者非典型弓形虫。于是后来就发展了多位点的PCR-RFLP的基因分型方法。

多位点的PCR-RFLP是选择多个含SNPs的基因进行PCR-RFLP的方法，该方法后来被广泛应用于弓形虫分子流行病学研究，并且随着研究的深入，多位点分析法也在不断的发展和完善，并且被大量用于弓形虫DNA多态性分析中。早在1995年，Howe和Sibley采用6个位点的PCR-RFLP方法调查分析了来自北美和欧洲西部的106株弓形虫，结果显示这些虫株主要属于3个基因型，分别是type I、type II 和 type III，其中只有4个分离株表现为 type I与 type II的重组或者 type II 与 type III 的重组基因型，由此推断弓形虫可能为单克隆系的种群结构[10]。后来，又有学者采用不同的多位点PCR-RFLP或微卫星分析法对来自其它不同地区的弓形虫株进行了流行病学和种群结构分析，结果显示，南美洲弓形虫株具有高度多样性，大多数是重组型弓形虫，与欧洲、北美的分离株有很大的差别[12-13]。

由于不同实验室选用的基因位点不尽一致，因此分型结果很难放在一起比较；另外，用于分型的多数基因为单拷贝基因，故当样品量少、DNA含量低，特别是临床或实验组织样品，该方法的敏感性就比较差。为解决上述问题，Dubey等2007年建立了针对10个遗传标记的多重多位点巢式PCR-RFLP (Mn-PCR-RFLP)方法[14]，这10个遗传标记包括SAG1，SAG2 alt. SAG2 ，(3′+5′)SAG2，SAG3，BTUB，GRA6，c22-8，c29-2，L358，PK1 和Apico。该方法首先利用外引物通过多重PCR方法扩增目的片段，再利用内引物进行巢式PCR分别扩增目的基因，最后酶切、电泳后对酶切图谱进行比对分析。与传统的PCR-RFLP相比，该方法的敏感性大大提高，检测限为10个弓形虫，传统的PCR-RFLP检测限是100个。另外，多重PCR也节约了大量的时间。目前，Mn-PCR-RFLP分析法已经广泛应用于弓形虫的基因分型，并且获得了大量有关弓形虫遗传多样性和群体遗传结构等方面的数据[13-14]。

3 微卫星分析法

微卫星序列是指广泛分布于染色体基因组中具高度多态性的简单串联重复序列，在弓形虫，这种重复序列一般比较简单，重复单位最少是2个核苷酸，重复次数为2～20次[12]，正是由于重复次数的差异，导致了DNA序列长度的多态性。一般认为，真核生物中微卫星序列的进化速度比较快，在每次复制中每个位点的突变率为10-2～10-5，而SNPs的突变率为10-9～10-10。通过对弓形虫3种主要基因型的大量分离株的研究发现，弓形虫的微卫星序列进化速度较慢[12,15]。虽然对弓形虫SNPs和微卫星序列精确的突变率尚不清楚，但是弓形虫微卫星序列的突变率要比SNPs的高，多态性要比SNPs好，在遗传学鉴定方面具有更高的分辨率。对微卫星序列的分析是通过PCR扩增和测序的方法完成的，该方法已经被广泛应用于锥虫[16]、利什曼原虫[17]、疟原虫[18]和隐孢子虫[19]的分型研究，弓形虫方面最早的研究是在1997年。到目前为止，至少有13个微卫星和1个小卫星被用于弓形虫分离株的基因型分析[12, 15, 20]，它们分布于已知基因的内含子内(如编码 β-微管蛋白的TUB2基因)及表达序列标签内等。该方法是所有分型方法中分辨率最高、准确性最好的。当样品量比较充足、对成本要求不高时，该方法是一个非常好的选择。为了提高该方法的敏感性，2005年，Ajzenberg等选择了其中的5个微卫星，建立了多重、多位点的微卫星分析法[21]。但与多位点Mn-PCR-RFLP分析法相比，由于成本高等方面的问题，该方法的应用受到了一定的限制。

4 随机扩增多态性DNA

随机扩增多态性DNA (Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD)是建立在PCR基础上的一种可对整个未知序列的基因组进行多态性分析的技术，它以单个人工合成的随机多态核苷酸序列(通常为10个碱基对)为引物，对基因组DNA进行扩增，通过电泳显示其片段的多态性。与常规PCR相比，RAPD技术无需设计特定引物，简便、快速、成本低、无放射性污染等，并且样品用量少，可对整个基因组做变异研究，该方法曾被用来区分弓形虫鼠毒力型和非毒力型虫株[22]。但是，RAPD图谱中某些弱条带的重复性较差，并且该方法在引物长度、引物序列、应用的引物数目和扩增反应条件等实验技术方面还未标准化，影响了不同条件下结果的可比性等。简单重复序列PCR(SSR-PCR)和RAPD相似，用的引物是单微卫星序列，重复性比RAPD好[22]，但由于宿主的DNA有可能会被扩增，这两种方法均不能对临床组织样品中弓形虫DNA进行扩增。

5 血清型分析法

血清型分析法是合成一些构成弓形虫抗原的肽类，这些肽是由弓形虫多态性的位点编码的，如GRA6和GRA7[23]。仅需通过检测宿主的血清抗体就可以对弓形虫的遗传学进行鉴定。但这种方法的成本比较高，目前尚未用于流行病学研究中。

6 内含子测序分析法

内含子是一个基因中非编码DNA片段，分开相邻的外显子。大量分子进化方面的研究发现，内含子对研究种内遗传进化方面也具有重要的意义[24]。内含子测序分析法是对内含子进行扩增测序，检测内含子序列内的SNPs。2005年和2006年Khan发现PCR-RFLP分析法并不能对弓形虫等位基因之间的多态性进行非常准确的评估，而弓形虫的内含子很适合进行种内系统发育的比较。其对来自免疫抑制病人和眼弓形虫病人的弓形虫分离株先进行多位点PCR-RFLP分析，发现其仅是重组基因型，再对其进行内含子测序，结果显示其出现了不同于古老克隆系的新的多态性[25-26]。这对进一步分析该虫株的起源具有很重要的意义。2007年Khan选择了8个内含子对46株弓形虫进行测序和种系进化分析，将这些虫株分为11个组，结果发现这些组之间有非常明显的地域分布差异[27]。因此，内含子分析法在研究弓形虫的遗传进化方面具有重要的意义。

Su等于2010年通过试验也进一步提出了测序内含子的重要性和必要性[2]，同时采用Mn-PCR-RFLP分析法和内含子分析法为研究弓形虫的遗传进化，区分单克隆系、重组基因型及新基因型提供了非常有力的工具，也为不同实验室间检测结果的比较分析奠定了基础。目前该方法已被广泛应用。测序的内含子包括UPRT-intron 1、UPRT-intron 7、GRA6、GRA7、EF1-intron1和HP-intron2[27-28]。

综上所述，弓形虫是一种真核细胞生物，其基因组比较复杂，而每种分型方法均有其优缺点，为能够准确地把握其遗传结构，要选择多个遗传标记进行综合分析。在上述方法中，目前被公认的、应用最广泛的是10 Markers Mn-PCR-RFLP方法，利用该方法已将弓形虫至少分为141个基因型(www.toxodb.org)。为了更全面地进行弓形虫遗传进化方面的研究，应再结合内含子测序法对其综合分析。

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