二苯乙烯苷对癫痫大鼠神经细胞增殖的影响及其机制探讨

吴隽松，成秀梅，罗 斌

(1. 盐城卫生职业技术学院医学院， 盐城 江苏 224005； 2. 湖北医药学院基础医学院，十堰 湖北 442000)

癫痫(epilepsy)为除脑卒中外最为常见的神经变性疾病，是由多种病因引起的慢性脑功能障碍综合征，其典型症状为大脑神经元发作性异常放电导致临床反复痫性发作，严重影响患者生活质量。近年来癫痫发病机制研究受到广泛重视，在神经递质、离子通道、突出的可塑性、神经胶质细胞等与癫痫的相关性方面做了大量研究。研究二苯乙烯苷(tetrahydroxystilbene glucoside，TSG)是何首乌中特有的水溶性生物活性成分，具有多种生物学功能，如提高学习记忆能力、改善神经细胞突触超微结构等[1-2]。目前的研究发现，癫痫发作可能导致神经元凋亡、坏死，继而产生神经细胞增殖，同时在癫痫发病过程中，神经细胞增殖往往伴随着明显的星形胶质细胞数量、形态学及生化指标的改变，可能是出于神经细胞代偿性保护、修复作用。本研究通过海人酸(kainic acid, KA)致痫大鼠模型模型，初步探讨二苯乙烯苷(TSG)干预对海马细胞增殖的影响及其可能的机制。

1 材料和方法

1.1 动物模型的建立及分组

SD大鼠，SPF级，(180～220)g，雄性，均由江苏省药物研究所提供。实验动物生产许可证号为：SCXK(苏)2005-0007，实验动物使用合格证号：SYXK(苏)2012-0042。动物分笼喂养于光照/黑暗为12/12 h 的恒温环境，每笼5只，自由摄食和饮水，保持整洁，2 d打扫一次鼠笼。取成年SD雄性大鼠54只，随机分成3组：假手术组18只、KA模型组18只、TSG干预组18只(通过预实验确定的剂量，给药剂量3 mg/kg)，造模前30 min腹腔注射给药，模型组、假手术组给予等剂量生理盐水。采用海人酸(KA)模型制备，SD大鼠脑立体定向仪固定后，选择右侧侧脑室为靶点，注射坐标为(ML 2.0, AP-1.0, DV-4.0)，将KA 1 μL (浓度为0.5 μg/μL )注射入侧脑室内，注射速度1 μL/min，留针10 min。大鼠癫痫发作2 h后腹腔注射地西泮10 mg/kg终止发作。TSG干预组致痫后6 h腹腔内注射TSG溶液(3 mg/kg)剂量，次日开始每日8时给与腹腔注射TSG溶液(3 mg/kg)剂量，每日1次，连续注射，共注射42 d，KA模型组动物及假手术组给予等量生理盐水腹腔内注射。

1.2 药品与仪器

TSG 购自中国药品生物制品检定所，含量大于98%，符合中国食品药品检定研究院制定的标准，HPLC标准[3]；BrdU及抗体购自美国Sigma公司；GFAP (glial fibrillary acid protein)抗体购自武汉博士德公司；二步法免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥公司；其他均为国产分析纯；冰冻切片机： Leica-CM1900；生物显微摄像系统：倒置荧光显微镜(Olympus CKX31)。

1.3 TSG给药方法动物实验

参考国内外相关文献及实验动物学药剂换算方法[4-5]，确定剂量为(3 mg/kg)。实验中采用干粉剂量、溶与蒸馏水制成药液，4℃保存。致痫后6 h腹腔内注射给药，次日开始每日8时给与腹腔注射，每日1次，连续注射六周，共注射42 d。模型组动物及假手术组给予等量生理盐水腹腔内注射。

1.4 BrdU 标记法

BrdU溶生理盐水，10 mg/mL (50 mg/kg)，每2 h注射1 次，共4 次。于各组大鼠于处死前1 d腹腔注射，最后1 次注射结束24 h后处死动物。

1.5 GFAP疫组织化学染色

所有组别分别在手术或者假手术后第42 天处死取脑。大鼠在0.07 g/mL水合氯醛麻醉下，分离暴露出心脏后经左心室插管至主动脉，先后灌注生理盐水200 mL，4%多聚甲醛磷酸缓冲液250 mL。灌毕取脑后置于40 g/L 多聚甲醛后固定6 h, 浸于30%蔗糖液内, 4℃条件存放24 h。取脑干于恒冷箱切片机(Leica-CM1900)行冠状冰冻切片, 片厚25 μm, 每隔5片取1 片, 每只动物取5 片, 取一套切片行SABC 免疫组织化学染色。以单克隆抗GFAP 抗体( 1:1000,武汉博士德) 作为I抗，生物素标记的羊抗鼠IgG (1∶200,武汉博士德)为二抗，DAB显色。显色之后, 常规脱水、透明和封片。

1.6 免疫组化染色图像分析

根据使用说明书进行BrdU的免疫组化染色操作。步骤：采用SP法，以小鼠抗BrdU单克隆抗体(Sigma)作为I抗，生物素标记的羊抗鼠IgG (1∶200，Sigma)为II抗，DAB显色。核内棕黄色颗粒为阳性着色。

1.7 BrdU标记细胞计数

应用Olympus倒置相差荧光显微镜观察免疫组化切片，Leica-CM1900数字纤维照相机采集图像，各组切片均在同一光强度下,同一放大倍数(400×)下分析。每例动物取两张切片，测CA1区域阳性细胞数目。随意取5个视野，确认并记录每个视野内海马GFAP、海马齿状回颗粒层BrdU阳性细胞数目，各组取平均值。

1.8 统计学方法

利用Image．Pro Plus5.0版软件进行图像处理，所有数据均采用SPSS 16.0版统计学软件包进行方差分析，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠海马星形胶质细胞的增生

假手术组、模型组、TSG干预组每视野内星形胶质细胞细胞计数分别为 (7.03±2.81)，( 13.32 ±1.85)，( 20.03 ±2.32) 个，方差分析差异显著( F=133.66,P=0.00)。两两比较, 均差异有显著性(图1，见文后彩插2)。

2.2 各组大鼠脑组织BrdU免疫组织化学染色观察

假手术组、TSG干预组、模型组每视野内星形胶质细胞细胞计数分别为 (46.16±2.48)， ( 37.67 ±1.21)，( 29.50 ±1.52) 个，方差分析差异显著( F=377.58,P=0.00)。模型组大鼠与对照组比较，海马齿状回区BrdU阳性细胞核明显增加(P<0.01)，TSG干预组与模型组相比，海马齿状回区颗粒细胞明显减少(P<0.01)，均具有显著统计学意义(图2，见文后彩插2)。

3 讨论

近年来有学者提出神经网络假说，该假说认为神经网络由神经元细胞和突起(轴突、树突)等组成，在基因和内环境的共同作用下，大脑神经元异常频繁放电可致大脑海马神经元广泛损伤甚至坏死、凋亡，并可以促使神经胶质细胞增生[6]。故癫痫脑损伤既是癫痫发作的果，又是癫痫频发的因。

GFAP是星形胶质细胞的细胞骨架蛋白，常被用来特异性标记星形胶质细胞。本研究发现癫痫发作后模型组在海马齿状回GFAP表达显著升高，细胞明显呈现激活状态，胞体增大且不规则，突起数量增多、形态增粗变长。Katsumoto等[7]认为癫痫发作的急性期引起的星形胶质细胞的激活可能参与K+、神经递质的调节，对于恢复脑神经元细胞外稳态有一定积极作用。在潜伏期，一方面星形胶质细胞自身大量增生，另一方面激活的星形胶质细胞通过释放一系列细胞因子引起小胶质细胞增生，占据脑内空间且干扰甚至切断了神经元之间或者神经元与胶质细胞之间的正常联系，故胶质细胞对神经元具有“双刃剑”的作用[8]。

Scharfman等[9]在癫痫大鼠齿状回区发现大量新生颗粒细胞，且这种异常的颗粒细胞可以无规律的结合、兴奋、爆发异常的兴奋性突触后电位(EPSP)。BrdU是一种胸腺嘧啶脱氧核苷类似物，在DNA合成过程中嵌入S期细胞的细胞核中，嵌入合成的强度显示其细胞增殖的能力强弱，因此BrdU被认为是反映新生活性细胞的理想指标。本研究发现，癫痫发生后，观察大鼠海马齿状回区颗粒细胞下层存在BrdU阳性细胞异常增殖，镜下呈圆形或者椭圆形结构。此结果与相关文献报到结果一致[10]。

本实验结果提示二苯乙烯苷能降低GFAP的过度表达，抑制星形胶质瘢痕形成，促进颗粒细胞增殖。近年来神经干细胞的增殖、分化、迁移成为神经系统疾病研究的新热点。有学者提出运用神经干细胞进行移植是修复和替代缺失神经元的有效方法，可部分重建神经网络，但这种内源性的再生修复因只有不到50%的神经元能够分化成熟并且迁移到受损部位成功建立突触联系，或者偏向不理想方向发展(如形成瘢痕)[11]。这使得干细胞移植成为可能，但中枢神经系统损伤后需借助干预条件动员神经干细胞，诱导其迁移、分化修复损伤，严格控制其神经再生作用。总之，神经干细胞在中枢神经系统创伤修复方面具有独特的优势，为神经移植与脑损伤修复指明了新的道路[12]。

参考文献：

[1] Zhang L, Yu S, Zhang R, et al. Tetrahydroxystilbene glucoside antagonizes age-related α-synuclein overexpression in the hippocampus of APP transgenic mouse model of Alzheimer′s disease [J]. Restor Neurol Neurosci, 2013, 31(1):41-52.

[2] 贾新，陈建宗. 二苯乙烯苷神经保护作用及其机制的研究进展 [J]. 国际中医中药杂志, 2007, 29(6):347-348．

[3] 班翊, 刘其礼, 金悠, 等. 二苯乙烯苷的含量测定及其稳定性研究 [J]. 中草药, 2004, 35(1):1235-1237.

[4] 王齐，陈晓宇，刘梅梅, 等. 二苯乙烯苷对沙鼠脑缺血/再灌注引发海马损伤的保护作用 [J]. 中国临床解剖学杂志, 2013, 31(2):180-183.

[5] 徐勇民, 周美鸿, 郑艳萍, 等. 二苯乙烯苷预适应对脑缺血-再灌注损伤大鼠细胞凋亡的保护作用 [J]. 南昌大学学报(医学版) , 2013, 53(5):13-16.

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[7] Katsumato E, Ozaki T, Yototano N, et al. The expression of glial fibrillary acid protein (GFAP)mRNA in EL mouse brain [J]. Epilepsia, 1997, 38(l6):61．

[8] Kaplan MS, Hinds JW. Neurogenesis in the adult rat: electron microscopic analysis of light radioautographs [J]. Science, 1977, 197(4308):1092-1094.

[9] Scharfman HE, Goodman JH, Sollas AL. Granule-like neurons at the hilar/CA3 border after status epilepticus and their synchrony with area CA3 pyramidal cells: functional implications of seizure-induced neurogenesis [J]. J Neurosci, 2000, 20:6144-6158.

[10] 张义伟, 肖培伦, 吕玥, 等. 癫痫发作后成鼠及幼鼠海马神经发生的改变 [J]. 神经解剖学杂志, 2013, 29(6):681-685.

[11] Lledo PM, Alonso M, Grubb MS. Adult neurogenesis and functional plasticity in neuronal circuits [J]. Nat Rev Neurosci, 2006, 7(3):179-193.

[12] Santos T, Maia J, Agasse F, et al. Nanomedicine boosts neurogenesis: new strategies for brain repair [J]. Integr Biol (Camb), 2012, 4(9):973-981.