弓形虫致密颗粒蛋白6（GRA6）的研究进展

（兰州市西固区动物疫病预防控制中心，甘肃兰州 730000）

弓形虫致密颗粒蛋白6（GRA6）的研究进展

王学俭

（兰州市西固区动物疫病预防控制中心，甘肃兰州 730000）

致密颗粒是由弓形虫致密颗粒细胞器分泌的一类具有免疫活性的蛋白质，它们在弓形虫的入侵，虫体在宿主细胞内的存活和繁殖方面起着重要作用。本文就致密颗粒蛋白6的分子结构、在虫体入侵中的作用、虫体基因分型以及在弓形虫病诊断和疫苗研制等方面的研究进展作一简要综述。

弓形虫；致密颗粒蛋白6；入侵；诊断；疫苗研制

弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种重要的机会性致病原虫，可寄生在多种哺乳动物（包括人）的有核细胞中，由其引发的弓形虫病在全世界范围内广泛流行，给人类健康和畜牧业发展造成了巨大的损失。致密颗粒蛋白（dense granule protein，GRA）是弓形虫体内重要的代谢分泌抗原，已知的致密颗粒蛋白有10种，在弓形虫病的诊断及免疫预防中存在潜在价值。而致密颗粒蛋白6由于其存在于速殖子和缓殖子中，与虫体在细胞内寄生、发育密切相关，近年来逐渐被人们所关注[1]，现将它的国内外研究进展状况综述如下：

1 GRA6的分子结构特征

GRA6无内含子，单拷贝，基因序列长为1632 bp，开放阅读框为735 bp，有两个起始密码子均可以作为起始密码，但第一个密码子更适合作为翻译的起始点。编码230个氨基酸，中部疏水区侧翼有两个亲水区，含有4组与GRA5蛋白同源的氨基酸。C-末端亲水区含24%的甘氨酸和29%的酸性残基，但N末端结构域并不符合信号肽特征。有一个潜在的N-糖基化点位于残基74位，含2个疏水区域，其中一个疏水区域位于偏向N端，另一个疏水区域位于中央处，具有跨膜结构域[2-3]。Lecordier等[4]把全部GRA6的开放阅读框序列导入表达载体pGEX，得到低表达量的不溶性融合蛋白，并又设计不同的引物，分别从弓形虫GRA6基因上扩增基因片段，导入表达载体pGEX，然后在大肠杆菌中进行表达、得到位于N端亲水区域蛋白抗原和位于C端亲水区域蛋白抗原，而只有编码N端重组抗原能被弓形虫感染人的血清所识别，表明GRA6 N端多肽含有被B淋巴细胞识别的抗原表位。GRA6与GRA5之间存在一定氨基酸序列上的同源性，因此有血清学上的交叉反应。

2 GRA6在弓形虫入侵中的作用

在弓形虫侵染脊椎动物细胞的实验中连续观察到微线体、棒状体和致密颗粒蛋白的出现[5-6]。弓形虫附着于宿主细胞引起顶端释放微线体蛋白MIC2，接着宿主细胞的胞浆膜内褶，释放棒状体蛋白ROP1，形成纳虫泡。致密颗粒是顶复门所特有的分泌细胞器，在入侵后不久，致密颗粒蛋白被大量的分泌入纳虫泡中。尽管存在很多疏水区域，它们仍然以可溶低聚物的形式进入纳虫泡，并且稳定的与纳虫泡膜相连。GRA4和GRA6在致密颗粒中初级包装为可溶性蛋白质，接着释放入纳虫泡。而GRA6主要由疏水作用来进行的，该蛋白质以磷酸化形式出现提示其同膜网络间关联的增加。GRA4、GRA6和GRA2相互作用，形成一个多聚体复合物，便于同泡内网络稳定地关联，该蛋白质多聚体的形成，依赖于蛋白质-蛋白质之间的相互作用和疏水作用，它还可能参与纳虫泡内营养物质或蛋白质的转运[9]。

Braun L等[7]用带有HA-FLAG标签的GRA2和GRA5蛋白与敲除GRA2和GRA5基因的弓形虫作用，再用亲和层析纯化，结果显示在弓形虫和纳虫泡的可溶部分内，GRA2-HA-FLAG 和GRA5-HA-FLAG和GRA6、GRA3相结合。这说明在致密颗粒中，GRA6、GRA2、GRA3、GRA5等结合在一起，通过将疏水区域包埋在内部而形成一个高分子量的可溶球状复合物。Mercier等[8-9]发现弓形虫侵入宿主细胞后，GRA6移至纳虫泡的后部，同GRA2一样，定位于一簇多层小囊泡，GRA2起着诱导纳虫泡表面网络结构形成的作用，GRA6的作用是稳定网络结构；随后Mercier等采用基因敲除技术，分别敲除了弓形虫的GRA2和GRA6基因，发现GRA2敲除株侵入宿主细胞后其纳虫泡不能正确形成，管状网络结构被一些小的凝集物取代，而且GRA6也不能正确的定位于管状网络结构上，GRA6敲除株虽然能够形成成熟的网络结构，但由于缺乏GRA6，排列有序的管状网络结构被小的囊泡所取代。

3 GRA6在弓形虫基因分型方面的研究

在弓形虫的分子遗传学研究中，PCR-RFLP被广泛应用于虫株基因型的研究。Fazaeli等[10]用核酸分析软件比较，已报道9株不同弓形虫地理株（TONT、CASTELLS、RUB、MAS、M7741、NED、ME49、BEVERLEY和RH）的GRA6基因序列，发现在N端区域基因较为保守，而C端区域有一定的差异；采用序列多态性分析，发现不同弓形虫株的GRA6基因存在着变异，通过序列比对，观察到在GRA6基因690 bp的序列中有24个核苷酸位点有多态性，弱毒株还有6个氨基酸的缺失，所有位点多态性均可导致氨基酸序列的改变，氨基酸序列的变化导致弓形虫不同虫株的抗原性和毒力发生差异。Howe等[11]对来自人和动物的106株弓形虫株DNA的6个酶切位点进行PCR-RFLP分析，根据基因序列相似性将106个虫株分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3个基因型，极少数虫株属于混合型。基因型Ⅰ的弓形虫是强毒株，在小鼠模型中致病性很强，产生高度虫血症；基因型Ⅱ与慢性感染之间具有密切关系，并使小鼠模型产生高负荷的包囊，人类弓形虫病主要与基因型Ⅱ的弓形虫株有关；基因型Ⅲ的弓形虫在动物体内出现的频率高于人。Fazaeli等[10]用MseⅠ酶对30株弓形虫的GRA6基因进行PCR-RFLP分析，结果显示GRA6基因可作为分子标记用于PCRRFLP分析，以区分弓形虫种株间的基因型。

Zia-Ali等[12]在伊朗Tehran和Mazandaran地区，以GRA6作为分型基因，对该地区中血清学检测为阳性的24只绵羊，5只山羊，23只野鸡，5只鸭，2只野猫，分离出弓形虫后进行基因分型，结果只发现基因II型和III型，未发现基因1型或者混合感染的情况。Peyron等为了研究弓形虫的种类，地域分布以及弓形虫病的临床症状等方面的内容，以GRA5 和GRA6为抗原用间接ELISA检测方法对来自欧洲不同国家及哥伦比亚252份慢性感染弓形虫的孕妇的血清进行分型，结果显示欧洲为II型弓形虫感染，哥伦比亚则为I和III型。谢德华等[13]首次对国内来自不同宿主的4个弓形虫虫株以及国际标准强毒株RH 株的GRA6 基因进行PCR-RFLP 分析，发现RH株、SH株、CN 3 株弓形虫的GRA6基因序列的MseΙ酶切位点与国外报道的RH 株一致，同属于基因型Ι为强毒株；QH株 和ZS 2株弓形虫的MseΙ酶切位点与国外报道的弱毒株BEVERLEY 株和ME49 株一致，同属于基因型Ⅱ。除MseΙ酶切位点外，中国的几个虫株GRA6 序列与GenBank中注册的RH株及BEVERLEY 和ME49 两株弱毒株有个别碱基的差异，这些差异可能是由于虫株的地域差异造成的。

4 GRA6在弓形虫病诊断和疫苗研制方面的研究

常用的弓形虫诊断试剂盒以速殖子作为诊断抗原，而速殖子一般经鼠腹水或组织培养中进行繁殖而获得，故带有各种不同的虫体外物质。由于缺少纯化的标准抗原或标准的纯化抗原的方法，各种实验结果也有所不同[14]。目前对弓形虫诊断的进展主要是通过抗原基因克隆与表达手段，用纯化的重组蛋白作为诊断抗原，检测感染者血清抗体。GRA6分子存在于弓形虫的致密颗粒及纳虫泡中并能分泌出来，当速殖子分裂并侵入细胞时，它便可作为抗原刺激机体免疫系统产生免疫反应，因而抗GRA6抗体可以作为早期活动性感染的指标。

Lecordie等分别从弓形虫GRA6基因偏N端和偏C端区域扩增基因片段，导入表达质粒pGEX，然后在大肠埃希菌中进行表达，得到位于偏N端亲水区域蛋白和位于偏C端亲水区域蛋白，而只有编码偏N端重组抗原能被弓形虫感染者血清所识别，用GRA6偏N端亲水蛋白多肽构建重组蛋白检测弓形虫感染者血清IgG 的敏感性达96%。李越希等[15]分别选择弓形虫GRA6 蛋白和P30 蛋白内的抗原性强、特异性好的部分片段，利用基因工程技术表达两者的融合蛋白，用该融合蛋白作为抗原，间接ELISA试验检测已知6份抗弓形虫阴性血清和6份抗弓形虫阳性血清。结果显示，6份抗弓形虫IgM 阴性血清均不显色，6份抗弓形虫IgM阳性血清均出现显色反应，说明该融合蛋白有较好的抗原性和特异性。另外检测了实验室保存的184份正常人血清，它们的A450值均小于0.05，进一步证实了该融合蛋白有较好的特异性。Fatoohi等用融合蛋白的方法，分别将GRA1 和GRA6 与谷胱甘肽-S-转移酶（GST）连接表达在大肠杆菌，ELISA 方法分别检测GST-GRA1 及GST-GRA6 被病人血清的识别率，发现GST-GRA1与GST-GRA6 可相互补充，使敏感性达到98 %。

Hofgartner等[16]为了准确诊断孕妇弓形虫病的感染情况，用GRA6的重组蛋白分别进行IgG和IgM间接ELISA试验，被检孕妇按发病症状分为三组：急性症状（I组），慢性症状（II组）和无症状（III组）。为了区分I组和II组，用GRA6-IgG-ELISA检测其敏感性分别为87.5% 和 94.1%，而用GRA6-IgM-ELISA检测，则敏感性分别为91.7%和2.9%，说明用GRA6的重组蛋白分别进行IgG和IgM间接ELISA试验，可以从血清学上区分孕妇弓形虫病的急性感染和慢性感染。Gatkowska等用六种弓形虫重组抗原GRA6，GRA1，GRA7，p35，SAG1，SAG2来检测小鼠感染弓形虫的情况。由小鼠感染不同虫株所制备的血清进行ELISA检测，急性感染的血清与GRA6，GRA7，p35有很高的反应性；而慢性感染的血清则与SAG1，SAG2反应强烈。这说明用不同的重组抗原可以在临床上鉴定弓形虫病的急性感染和慢性感染，GRA6作为一个理想的重组诊断抗原可以检测弓形虫病急性感染的情况。Redlich等用重组的GRA6-GST融合蛋白作为检测抗原，检测了431份来自急、慢性弓形虫感染病人的血清样本，其中对急性弓形虫病检测的特异性达到99.6%，对随机抽取的159份血清样本进行检测，阳性率仅为4.0%。

朱翔等[17]分别从弓形虫昆山分离株和RH株总DNA中扩增到编码GRA6偏N端的基因片段，经分析基因序列基本一致，故其重组蛋白可用于对不同地理株弓形虫感染的诊断；再将构建的重组质粒pGEX-GRA6转化大肠埃希菌中表达，免疫印迹分析证实该重组蛋白能被抗弓形虫血清特异IgM和IgG抗体识别，而纯化的GST蛋白未能被血清识别，其结果与Makioka等[20]报道的一致，显示了GST-GRA6重组蛋白的良好免疫反应性，可以被急性和慢性期弓形虫感染者血清中IgM和IgG抗体所识别。

GRA存在于弓形虫速殖子阶段和缓殖子阶段，可作为急性感染和慢性感染的诊断抗原及可能的疫苗成分。尽管有一些报道了弓形虫其他蛋白抗体的保护效果，但是关于GRA6抗体的保护作用报道的很少。因此Cha等进行了一系列试验用来评估致密颗粒蛋白（GRA2，GRA6）和表膜蛋白1（SAG1）的单克隆抗体在弓形虫速殖子入侵上的抑制效果；用以上单克隆抗体被动免疫小鼠，然后再用致死剂量的速殖子攻击小鼠，其存活时间明显延长；用GRA6和SAG1的单克隆抗体预先处理的速殖子攻击小鼠，其存活时间也明显延长；而用两种单克隆抗体同时处理过的速殖子攻击小鼠其存活时间则比任何一种都要长。用GRA6单克隆抗体处理过的成纤维细胞和巨噬细胞对速殖子的入侵起到很强的抑制作用。以上试验说明GRA6的抗体对控制弓形虫感染起到一定作用。

5 展望

GRA6序列的多态性，特别是其序列上含有的MseΙ酶切位点，通过PCR-RFLP技术，已经成为国内外学者进行弓形虫虫株分类的首选基因之一；利用GRA6在纳虫泡中特殊的作用机理，GRA6蛋白自身良好的反应性，GRA6蛋白在临床检测弓形虫病感染以及感染的病程上，也已被愈来愈多地应用。然而，GRA6蛋白作为保护性抗原方面的研究却很少，在国内尚未有这方面的报道。是否将其研制为集基因分型、诊断、免疫为一体的多功能基因还有待于进一步研究。如果可行，这将为弓形虫病的综合预防，诊断试剂的研制起到很大的促进作用。

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Research progress on dense granule protein 6 of Toxoplasma gondii

Wang Xuejian
（Xigu Center for Animal Disease Control and Provention，Gansu，Lanzhou 730000）

Dense granules are a series of immunologically competent proteins secreted by dense granule organelle of Toxoplasma gondii，and play important roles in the invasion，survival and propagation of Toxoplasma gondii. This paper reviews the progress in research of dense granule protein 6 including molecular structure，the function to invade，genotyping，diagnosis and vaccine development for toxoplasmosis.

Toxoplasma gondii；Dense granule protein 6；Invadsion；Diagnosis；Vaccine development

S 852.723

：A

：1005-944X（2014）02-0045-04

国家自然科学基金项目（31001061）。