RNA干扰技术在医学领域的应用

郑 露，周 剑

（重庆市食品药品检验所·重庆市药物过程与质量控制工程技术研究中心，重庆 401121）

RNA干扰技术（RNA interference，RNAi）是正常生物体内抑制特定基因表达的一种现象，是指当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，通过一系列细胞内反应引起细胞中mRNA发生降解而导致基因表达沉默。RNA干扰现象最早可追溯到20多年前。1990年为加深矮牵牛花的紫色，有人[1]导入了一个强启动子控制的色素基因，可是结果与预期相反，许多花瓣颜色并未加深，反而呈杂色甚至白色。这是由于转基因和同源的内源基因的表达都被抑制了，Jorgensen把这个现象命名为共抑制（cosuppression）。这种基因抑制是发生在转录后水平的，因此又称为转录后基 因沉默 （post－ transcriptional gene silencing，PTGS）。2001年，Elbashir等[2]在哺乳动物细胞中用化学合成的21nt的双链 RNA(double－stranded RNA，dsRNA)诱导产生了特异性 RNAi，RNAi技术迅速扩展到哺乳动物领域。1995年，Guo等[3]在试图阻断秀丽新小杆线虫（C.elegans）中的 par－1基因时，发现了正义与反义 RNA同样能切断 par－1基因的表达。1998年，Fire等[4]在利用反义RNA进行线虫基因阻断时，发现双链RNA能够引起的mRNA降解，于是将这一现象称为RNAi。

1 原理

RNAi的作用机制被认为包括起始阶段、效应阶段、扩增和扩散阶段[5]。

起始阶段：较长的dsRNA在ATP参与下被RNaseⅢ样的特异核酸酶切割加工成21～23 nt的由正义和反义链组成的小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）。siRNA 的两条单链末端为 5′磷酸和 3′羟基，且 3′端均有 2～3个突出的核苷酸。果蝇中的RNaseⅢ样核酸酶称为 Dicer。Dicer有解旋酶活性并含有 dsDNA结合域和PAZ结构域。Dicer的类似物相继在拟南芥、秀丽线虫及哺乳动物等机体中被发现。

效应阶段：siRNA在ATP参与下被RNA解旋酶解旋成单链，并由其中反义链指导形成RNA诱导的沉默复合体（RNA－induced silencing complex，RISC）。活化的 RISC在单链 siRNA引导下识别互补的信使核糖核酸(messenger RNA，mRNA)，并在 RISC中的核酸内切酶作用下从siRNA引导链中心所对应的靶基因位置切割靶mRNA，最后可能再被核酸外切酶进一步降解，从而干扰基因表达。RNAi能高效特异地阻断基因的表达，在线虫，果蝇体内，RNAi能达到基因敲除的效果。

扩增和扩散阶段：siRNA不仅可引导RISC切割靶RNA，而且可作为引物在RNA依赖的RNA聚合酶作用下以靶mRNA为模板合成新的dsRNA。新合成的长链dsRNA同样可被RNaseⅢ样核酸酶切割、降解而生成大量的次级siRNA。次级siRNA又可进入合成、切割的循环过程，进一步放大RNAi作用。这种合成、切割的循环过程称为随机降解性聚合酶链反应（random degradative，PCR）。

2 应用

2.1 抗病毒

病毒善于变异，适应性强，且感染的场所是在细胞内，故病毒感染性疾病较难治愈，一直以来是威胁人类健康的主要因素。RNAi为抗病毒研究提供了一个重要的策略。目前，人们用RNAi技术在人免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒等的多种抗病毒研究中取得了很多进展。Randall等[6]证明了针对HCVRNA的siRNA转染细胞4 d后可使细胞质中复制的HCV－RNA降低80倍；Kapadia等[7]也证明了 siRNA特异抑制 HCV－RNA复制、阻止相关蛋白表达的作用。

2.2 肿瘤的基因治疗

用RNAi特异性地抑制癌基因、癌相关基因或突变基因的过度表达，使这类基因保持在静默或休眠状态，从而有望用这种新的手段治疗各种恶性肿瘤。目前，发现促癌基因的激活、杂合等位基因的丧失及与肿瘤生物学特性相关基因的表达异常等因素与肿瘤发生发展密切相关。这些异常表达基因的蛋白产物与正常组织细胞的同类蛋白并无差异，因此在蛋白水平抑制它们的表达，不能很好地区分正常细胞和恶性肿瘤细胞。但这些基因变异往往反应在mRNA水平上，故siRNA很可能成为能够特异作用于肿瘤的理想抗癌药物。Calin GA等[8]首次证明了miRNA在某些类型的白血病和淋巴瘤患者体内发生了功能障碍，其中2种 miRNA（miR215和miR216）起着关键作用。癌基因ras在大约20%的癌症中因突变而发生了过表达或活化。Johnson等[9]发现ras受Let－7家族的调控，其中包括线虫的 ras基因、人的 k－ras、h－ras和 n－ras基因。Takamizawa J等[10]首次发现了let－7 miRNA在肺癌中低表达。最近，Hayashita Y等[11]又发现了一个与肺癌相关的miRNA簇——miR－17－92，miR－17－92在多数肺癌细胞株中过量表达，而且导入外源miR－17－92可显著促进肺癌细胞的生长。He L等[12]证实，miR－17－92在B细胞淋巴瘤中也呈高表达状态。由于RNAi具有高度的特异性并能高效调节其靶基因的表达，近年用RNAi技术在多种不同的肿瘤细胞中成功干扰了多种靶基因的表达，抑制了肿瘤细胞的生长，已成为目前肿瘤治疗的研究热点。

2.3 心血管疾病治疗中的应用

有学者已将RNA干扰技术成功运用于先天性心脏病、扩展性心肌病、病毒性心肌炎、心力衰竭、心肌肥厚等，如成簇粘附激酶（focaladhesionkinase，FAK）信号通路在心肌肥大中起了重要作用。Clemente等[13]将针对 FAK的siRNA通过颈静脉注入小鼠体内，从而减少心肌纤维化，阻止了心肌的肥厚。

2.4 其他疾病治疗中的应用

RNAi技术正越来越多被应用于其他许多疾病的治疗研究。如内分泌系统中的糖尿病，血液系统中的镰状细胞性贫血，消化系统中的肝纤维化，呼吸系统中的急性肺损伤等。

2.5 药物开发中的应用

RNAi技术作为寻找新的药物靶标的工具，可以快速、大规模、高通量的对发现的药物靶基因进行功能分析。同时，基因药物具有高度的序列特异性和非常小的药物不良反应，利用这个技术可以用于确定人类细胞中的疾病途径，为小分子药物筛选靶物质以及建立新的生物制药方法和诊断学方法。

3 面临的问题

效率不高的载体系统。基因的靶向转运未完全实现，成为RNAi技术能否进入临床应用的关键问题。近年来在新型载体的开发、应用单链片段抗体技术选择性导入siRNA及siRNA的化学修饰以提高生物稳定性等方面研究取得了一定的进展，有望加快突破这个障碍[14－15]。

RNAi的特异性是相对的。某些情况下siRNA能在翻译水平抑制与之不完全相关的基因表达，即“脱靶”现象，须从siRNA的设计，siRNA的位置特异性修饰等方面研究解决的方法[16－17]。RNAi的具体分子机制研究。

RNAi机制本身受哪些因子调控，不同种生物是否沿用同一种RNAi机制，RNAi的生物功能研究等方面的认识还不足。

其他问题包括对基因认识的广度和深度还难于满足实际应用的需要，未实现在体内准确操控外源基因表达的时间性和空间性。

4 结语

随着人类基因组计划的完成，后基因组时代已经到来，基因功能的研究越来越重要。最近兴起的RNA干扰技术，以其快速、简便、高效的抑制基因表达受到科学家们极大的关注，成为基因治疗的极具潜力的工具。目前RNA干扰在生物化学、分子生物学、制药、医学等各个领域得到了广泛的应用，随着技术的成熟，相信在不久的将来这一技术会在生命科学的领域中大有作为，成为遗传学与分子生物学研究的有力工具。

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