容积敏感性外向整流氯离子通道的调节机制及药理学探讨＊

杨 磊，王晓明

(中国人民解放军第四军医大学西京医院老年病科，陕西 西安 710032)

作为哺乳动物基本单位的细胞，其内外存在各种离子(Na+，K+，Cl－)，其环境变化是导致疾病的基础。除阳离子外，阴离子也发挥着至关重要的作用。Cl－是体内最丰富的阴离子，它进出细胞的过程，除 Cl－－HCO3－交换及 Na+－Cl－，Na+－K+－2Cl－和 K+－Cl－联合转运外，经过阴离子通道进行转运是重要方式之一，由于在生理条件下阴离子通道介导的离子转运主要为Cl－，所以通常称为氯离子通道。氯离子通道广泛存在于各种细胞上，但因其电导较小、研究难度较大以及缺乏特异性抑制剂等因素，使其相关研究存在很多问题。随分子生物学和电生理方法的结合，氯离子通道的研究进入了快速发展时期。同时，随着新药创新的研发，与其相关的中药单体研究也成为焦点。心脏Cl－通道研究发现了6种不同的 Cl－电流[1－2]，目前认为存在4种 Cl－通道，即 CFTR 基因编码的Cl－通道，ClC－3编码的，ClCA1编码的，ClC－2编码的。其中与ClC－3密切相关的容积敏感性外向整流氯离子通道(VSOR)在维护和调节细胞内环境稳定中起着至关重要的作用[3]，并与细胞的退行性改变及存亡密切相关。

1 生理学特性及生物电活动

VSOR电流广泛表达于几乎所有脊椎动物的细胞中，在维持细胞正常容积的动态平衡中发挥着重要作用[4]。在细胞的体积增大及调节性容积减小(RVD)过程中，VSOR发挥核心作用，RVD的完成主要通过氯通道和钾通道使Cl－和K+外流，而完成细胞容积减小的过程。目前认为，在心肌细胞，容积调控氯电流不仅对生理状态下细胞的容积调节起重要作用，而且与心肌细胞的多种病理生理过程有关。

在哺乳动物，细胞肿胀后都能激活典型的阴离子电流，在生理条件下，该电流主要为Cl－，所以通常称为容积调控氯电流。该电流典型的生物物理学特点为[5]:1)通道的离子选择性通透顺序为 SCN－＞I－＞NO3－＞Br－＞Cl－＞F－＞gluconate－[6]，对较大的阴离子如天冬氨酸、谷氨酸、氨基乙磺酸均有通透性;2)该电流的激活是非电压依赖性的，但在电压超过+60 mV时，出现缓慢失活，在负电压时，该电流快速复活;3)虽然胞外Cl－浓度高于胞内，但由于平衡电位的存在，该电流表现为轻度的外向整流特性，去极化时无明显的时间依赖性。在一些细胞，可能由于通道蛋白有所不同，Icl，vol没有明显的整流和失活过程;4)在牛肺动脉血管内皮细胞，正电压时单通道电导是4～40 pS，在负电压时电导为4～10 pS，需要注意的是，VSOR并非唯一的肿胀激活的氯通道;5)无特异性阻断剂，VSOR最有效的阻断剂有4，4'－二异硫氰基芪 －2，2'－二磺酸 (4，4'－diisothiocyanatostilbene－2，2'－disulfonate，DIDS)、5－硝基 －2－(3－苯丙胺)－苯甲酸[5－nitro－2－(3－phenylpropylamino)－benzoic acid，NPPB]、雌激素受体拮抗剂他莫昔芬(tamoxifen)。他莫昔芬最开始用作雌激素受体阻断剂，后来发现它能特异性地抑制Icl，vol，其他一些阻断剂，如蒽－9－羧 酸 (anthracene－9－carboxylic acid，9－AC)、尼 氟 灭 酸(niflumic acid，NFA)、氟芬那酸 (flufenamic acid，FFA)、格列苯脲(glibenclamide)、IAA－94也能抑制VSOR氯通道。

2 调节作用机制

Duan等[7]通过对心脏糖蛋白、ClC－3在NIH/3T3成纤维细胞上的克隆表达试验发现了与Icl，vol一致的容量敏感度氯电流。蛋白激酶C(PKC)和丝氨酸/苏氨酸磷酸酶可以调节此电流，ClC－3抗体可以产生抑制作用。各种因素导致的细胞容量变化通过信号级联放大调节Icl，vol、PKC、酪氨酸蛋白激酶的磷酸化及细胞骨架可对其产生调节作用。在鸡心脏的Icl，vol研究中，研究者发现抑制酪氨酸蛋白激酶可以减弱Icl，vol，经PKC抑制剂处理的细胞在PKC激活剂作用下无Icl，vol产生，使用细胞松弛素B破坏丝状肌动蛋白，细胞外低渗不能激活Icl，vol，说明酪氨酸蛋白激酶、PKC、细胞骨架都是Icl，vol调节中的重要因素[8]。磷酸化在 VSOR激活中的作用还有待于证实。

Crepel等[9]学者发现，星形胶质细胞的增殖与酪氨酸激酶激活VSOR有关。其他研究者也发现了酪氨酸磷酸化的作用。与此同时，Lepple－Wienhues等[10]研究发现，p56Ick激酶调整酪氨酸磷酸化参与了细胞容积调节过程，敲出p56Ick的细胞无法记录到容积调控氯电流，但在转染野生型DNA或在剪切的膜片上加入该激酶后，该电流又出现;另外，低渗肿胀时该激酶的活性增高。有报道显示，Icl，vol在鼠成纤维细胞，磷酸酪氨酸磷酸酶抑制剂能抑制RVD与氯电导[11]。研究表明，加入GTP可使Icl，vol时程延长，而加入GDPβγ则抑制该电流。他们得出结论，VSOR激活机制中有G蛋白参与[12]。在胞内ATP处于低水平时，Mg升高能抑制 Icl，vol细胞内Cl－浓度增高时，将出现VSOR的激活容积增大或活性降低[13]。一些蛋白激酶通路在VSOR激活中的作用被广泛研究。其中，cAMP和cAMP依赖的PKA磷酸化对Icl，vol的作用存在着许多争议[14]。十字胞碱(STS)可能通过PI3K/Ak机制激活心肌细胞容积敏感性外向整流氯离子通道[15]。

3 对细胞凋亡的影响

凋亡是活体内个别细胞的程序性死亡，是因体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致细胞主动性死亡的形式。凋亡性细胞皱缩(AVD)，是细胞凋亡的一个普遍且重要的特征，而维持细胞体积恒定，VSOR起着重要作用[16]。当细胞处于低渗环境中，由于渗透压的作用，水被动流入细胞，肿胀的细胞可激活氯离子通道开放，从而使胞内大量离子及水分外流，最终使细胞回复其原来的体积大小，这种细胞肿胀后发生的容积减小即调节性容积回缩。

研究表明，在小鼠心房肌细胞和脂肪细胞中，提高VSOR氯通道电流可加速RVD过程[17]。当细胞处于高渗环境中，由于渗透压的作用，水被动流出细胞，细胞发生皱缩，为了重新达到“正常”容积，细胞会发生调节性容积增大(RVI)。RVI的发生主要与Na+－K+－2Cl－同向转运体，Na+－Cl－同向转运体和 Na+/H+交换体等有关[18]。

已有研究表明，VSOR参与了RVI的发生，而且高渗环境中氯离子电流的减少可反映出VSOR活动受抑制[19]。AVD的发生主要和容积调节性K+和Cl－通道的激活有关。AVD的诱导伴随着RVD的易化，在此过程中总是伴随有容积调节性K+和Cl－通道的激活，Cl－通道的活动可能是AVD的一个必要条件。

4 与心血管疾病的关系

目前，主要认为氧自由基、钙超载、活化的中性白细胞、心肌纤维能量代谢障碍、血管内皮细胞、一氧化氮、细胞黏附因子和细胞凋亡等都可能参与心肌缺血－再灌注损伤(MI/R)的发病过程[20]。现已证实，在MI/R中存在激活VSOR，通过RVD和缺血时产生的亲脂代谢物及细胞内外氯离子浓度变化影响氯离子通道。研究发现，VSOR的非选择阻滞剂DIDS或NPPB可以减少再灌注期的细胞凋亡数，但对缺血期影响不大;说明VSOR参与了缺血－再灌注引起的细胞凋亡过程的调节[21]。

氯离子通道阻滞剂DIDS具有保护MI/R损伤的作用，可减少再灌注后的心律失常、抑制心肌酶释放和改善心脏的功能，并且在MI/R诱导的凋亡性心肌细胞损伤中，氯离子通道阻滞剂也能有效地抑制Caspase－3活性，保护受损的心肌细胞。Liu等[22]研究发现，DIDS抑制心肌细胞凋亡可能与抑制促凋亡分子Bax由胞质向线粒体转位有关。

5 针对VSOR发挥作用的药理学研究

基于近年来对氯离子的深入探索，不管是基础研究还是临床研究，都说明VSOR与人类疾病息息相关。阻断氯离子通道会对缺血性心肌病起到保护作用，但针对其通道阻滞剂尚无特异性的药物发现，其非特异阻滞剂较多，且被广泛应用于各种研究试验，不同细胞要选用不同的阻滞剂。Cl－电流参与动作电位，阻断其可延长动作电位时程起到抗心律失常的作用，这可能成为新一代抗心律失常药物的突破口。到目前为止，对于阴离子通道，实现特异性激活或阻断并不容易。大多数氯离子通道阻滞剂或激活剂都不是高特异性的，所以使用这些阻断剂或激动剂必然会出现很多负作用。由此可见，通过离子通道学研究筛选高特异性阻滞剂或激动剂是药理学研发的焦点。

近年来，随着科技的进步，药物分析学、化学、生理学等学科参与了中药的研发，对中药的认识有了进一步的深入[23]。中药单体制备成为医药界的潮流及焦点，对中药单体的研究需要借助现代手段和技术，根据细胞膜色谱法[24]在细胞水平筛选的独特优势，对其中药有效成分进行筛选和验证。加之临床上多种中药广泛应用于治疗心血管疾病，如丹参具有扩张血管、降压、抗血栓的作用，对冠心病、心绞痛、心动过速有明显疗效。近年来，高效小分子组合化合物和天然化合物对VSOR功能的调节作用成为研究的热点。

VSOR对维持细胞容积平衡、细胞增殖、细胞周期、影响细胞凋亡、调节细胞的电活动等多种生物功能发挥重要作用。近年来，人们发现丹参酮ⅡA可能通过某些信号转导途径，激活细胞膜氯离子通道，诱发细胞凋亡性容积减小，诱导细胞凋亡，该中药单体也通过膜片钳技术得到了验证[25]。利用氯离子通道细胞荧光测定模型和电生理测定分析，从中药单体化合物中发现并研究了天然小分子化合物人参皂苷元－20(S)－原人参二醇(protopanaxadiol)对野生型和AF508突变型CFTR Cl－通道的激活作用[26－27]。

6 展望

在过去20多年中，心脏氯离子通道的研究经历了一次从新发现和快速发展的时期，无论通道功能还是调节机制方面都取得了重要进展，但对心肌氯离子通道的认识还远远落后于阳离子通道。尤其在VSOR分子结构、基因定位研究方面，至今尚未确定。最近一项研究表明，TMEM16F是Ca2+激活Cl－通道的一个组成部分，但不是容积敏感性外向整流氯离子通道[28]。随着分子生物学的发展和膜片钳的应用，离子通道的结构和功能研究可望得到进一步发展，也必定能极大地促进心脏氯离子通道的研究和发展。

[1]Sardini A，Amey JS，Weylandt KH，et al．Cell volume regulation and swelling － activated chloride channels[J]，Biochemica et Biophysica Acta，2003，1618(2):153 －162．

[2]Hume JR，Duan D，Collier ML，et al．Anion transport in heart[J]．Physiol Rev，2000，80(1):31 － 81．

[3]Weylandt KH，Valverde MA，Nobles M，et al．Human ClC －3 is not the swelling－ activated chloride channel involved in cell volume regulation[J]．J Biol Chem，2001，276(20):17 461 －17 467．

[4]Okada Y．Volume expansion－sensing outward－retifier Cl－channel:fresh start to the molecular identity and volume sensor[J]．Am J Physiol，1997，273(3 Pt 1):C755 － 789．

[5]Eggermont J，Trouet D，Carton I，et al．Cellular function and control of volume regulated anion channels[J]．Cell Biochem Biophys，2001，35(5):263－274．

[6]d’Anglemont de Tassiguy A，Soukani R，Ghaleh B，et al．Structure and pharmacology of swelling － sensitive chloride channels，I(C1，swel1)[J]．Fundam Clin Pharmacol，2003，17(5):539 － 553．

[7]Duan D，Cowley S，Homwitz B，et al．A serine residue in ClC －3 links phesphorylation－dephosphorylation to chloride charmel regulation by cell volume[J]．J Gen Physiol，1999，113(1)，57 － 70．

[8]Wei H，Mei YA，Sun JT，et al．Regulation of swelling－ activated chloride channels inembryonic chickheartcells[J]．CellRes，2003，13(1):21 －28．

[9]Crepel V，Panenka W，Kelly ME，et al．Mitogen － activated protein and tyrosine kinases in the activation of astrocyte volume－activated chloride current[J]．J Neurosci，1998，18(4):1 196 － 1 206．

[10]Lepple － Wienhues A，Szabo I，Laun T，et al．The tyrosine kinase p56lck mediates activation of swelling－induced chloride channels in lymphocytes[J]．J Cell Biol，1998，141(1):281 － 286．

[11]Thoroed SM，Bryan－Sisneros A，Doroshenko P．Protein phosphotyrosine phosphatase inhibitors suppress regulatory volume decrease and the volume － sensitive Cl－conductance in mouse fibroblasts[J]．Pflugers Arch，1999，438(2):133 － 140．

[12]Doroshenko P，Neher E．Volume－sensitive chloride conductance in bovine chromaffin cell membrane[J]．J Physiol，1992，449(4):197 － 218．

[13]Doroshenko P．High intracellular chloride delays the activation of the volume－sensitive chloride onductance in mouse L －fibroblasts[J]．J Physiol，1999，514(Pt 2):437 － 446．

[14]Sorota S．Swelling－induced chloride－sensitive current in canine atrial cells revealed by whole － cell patch － clamp method[J]．Circ Res，1992，70(4):679－687．

[15]Liu Y，Wang B，Zhang WW，et al．Modulation of Staurosporine－Activated Volume－Sensitive Outward Rectifying Cl－Channel by PI3K/Akt in Cardiomyocytes[J]．Curr Pharm Des，2013，19(27)4859 －4864．

[16]Okada Y，Shimizu T，M aeno E，et al．Volume－sensitive chloride channels involved in apoptotie volume decrease and cell death[J]．J Membr Biol，2006，209(1):21 － 29．

[17]Inoue H．Takahashi N，Okada Y，et al．Volume－sensitive outwardly rectifying chloride channel in white adipocytes from normal and diabetic mice[J]．Am J Physiol Cell Physiol，2010，298(4):C900 － C909．

[18]Bachmann O，Heinzmann A，Mack A，et al．Mechanisms of secretion －associated shrinkage and volume recovery in cultured rabbit parietal cells[J]．Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2007，292(3):G711－G717．

[19]Winpenny JP，Mathews CJ，Verdon B，et al．Volume － sensitive chloride currents in prim ary cultures of human fetal vas deferens epithelial cells[J]．PflugersArch，1996，432(4):644 － 654．

[20]Prasad A，Stone GW，Holmes DR，et al．Reperfusion injury，microvaseular dysfunction，and cardioprotection:the“dark side”of reperfusion[J]．Circulation，2009，120(21):2 105 － 2 112．

[21]Wang XM，Takahashi N，Uramoto H，et al．Chloride channel inhibition prevents ROS－dependent apoptosis induced by ischenmia－reperfusion in mouse cardiomyocytes[J]．Cell Physiol Biochem，2005，16(4－6):147－154．

[22]Liu AH，Cao YN，Liu HT，et al．DIDS attenuates staurosporine－induced cardiomyocyte apoptosis by PI3 K/Akt signaling pathway:activation of eNOS/NO and inhibition of Bax translocation[J]．Cell Physiol Bio Chem，2008，22(1－4):177－186．

[23]徐砚通，王 钊．后基因组时代的中药现代化研究——中药化学和中药药理学展望[J]．中国中医基础医学杂志，2001，7(2):18－20．

[24]苗 奕，温守明，季小慎．亲和色谱法的研究进展[J]．国外医学:药学分册，1999，26(1):41－44．

[25]李 媛，刘善文，陈丽新，等．丹参酮ⅡA对低分化鼻咽癌细胞氯通道的激活作用[J]．中国药理学通报，2011，27(9):1 205－1 209．

[26]刘 军，那万里，麻彤辉，等．20(S)－原人参二醇促进CFTR氯离子通道开放[J]．高等学校化学学报，2008，4(1):731－734．

[27]Ma T，Thiagarajah JR，Yang H，et al．Thiazolidinone CFTR inhibitor identified by high－throughput screening blocks cholera toxin－induced intestinal fluid secretion[J]．J Clin Invest，2002，110(11):1 651－1 658．

[28]Shimizu T，lehara T，Sato K，et al．TMEM16F is a component of a Ca2+－activated Cl－channel but not a volume－sensitive outwardly rectifying Cl－channel[J]．Am J Physiol Cell Physiol，2013，304(8):C748 － C759．