YAP调控人胶质瘤细胞生长的体外研究*

于福华 贾志凡 浦佩玉 王广秀 张安玲 杨卫东

YAP调控人胶质瘤细胞生长的体外研究*

于福华 贾志凡 浦佩玉 王广秀 张安玲 杨卫东

目的：研究YAP（Yes-associated protein）调控人脑胶质瘤细胞系LN229细胞生长的作用。方法：采用YAP干扰RNA（siRNA）敲低LN229细胞中YAP的表达，Western Blot法鉴定肿瘤细胞中YAP是否已被敲低；MTT比色法测定YAP敲低后对肿瘤细胞增殖的影响；Transwell实验检测胶质瘤细胞侵袭能力的变化；流式细胞术和AnnexinⅤ标记法分别检测胶质瘤细胞周期及凋亡的变化。Western Blot法检测相关蛋白。结果：经Western Blot法检测证实转染YAP siRNA后LN229细胞中YAP被有效敲低；敲低LN229细胞中YAP表达，可以抑制胶质瘤细胞增殖，阻滞细胞周期于G0/G1期，并可抑制细胞侵袭能力，促使细胞凋亡数显著增加。促增殖蛋白Ki-67、促侵袭蛋白MMP-9、促周期进展蛋白Cyclin D1以及凋亡相关蛋白Bcl-2表达明显下调。结论：敲低人胶质瘤细胞中YAP活性可以抑制肿瘤细胞增殖和侵袭，促进凋亡，为进一步探究Hippo-YAP信号通路在胶质瘤中的分子病理机制中的作用提供依据。

胶质瘤 YAP Hippo信号通路 凋亡 侵袭

胶质瘤是人类难治性肿瘤之一。约40%原发性脑肿瘤起源于胶质细胞，即胶质瘤，而原发性恶性脑肿瘤中约77%为恶性胶质瘤［1］。目前公认的恶性胶质瘤标准治疗方案为手术切除肿瘤，辅以替莫唑胺化疗和放疗［2-3］。然而，这些临床治疗方法成效有限，恶性胶质瘤患者的中位生存期约为确诊后12～18个月，而5年生存率仍不足10%［4］。胶质瘤的分子病理机制研究从以往着眼于单个基因及其编码蛋白的改变，发展到研究多基因的信号通路调控及其信号调控网络变化。YAP（Yes-associated protein）是Hippo-YAP信号通路下游的效应因子，Hippo信号通路一旦被激活，上游激酶磷酸化YAP，被磷酸化的YAP能够与细胞骨架蛋白14-3-3蛋白相互作用，停留在胞质内，不能进入细胞核激活基因转录。当Hippo通路被抑制，YAP不能被磷酸化，则进入细胞核，与核内的转录因子相互结合，启动下游靶基因的转录。在结肠癌、肺癌、肝癌中已发现YAP在细胞核内高表达。但YAP与胶质瘤的研究目前报道甚少，鲜见关于YAP与胶质瘤细胞生物学行为的基础研究。为了进一步探讨YAP与胶质瘤细胞生长的关系，本研究采用YAP siRNA敲低LN229胶质瘤细胞中YAP表达，观察其对胶质瘤细胞生物学行为的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

YAP siRNA的序列为5'-CUGCCACCAAGCUA GAUAATT-3'；反义序列为5'-UUAUCUAGCUUGG UGGCAGTT-3'，由上海吉玛公司合成；Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司。LN229胶质瘤细胞株购自中国科学院上海细胞生物学研究所中国科学院细胞公司。Transwell板购自美国Corning公司。所用抗体分别购自美国CST公司及北京中杉金桥公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与YAP siRNA转染 采用DMEM培养液加10%胎牛血清于37℃、5%CO2温箱培养细胞。转染时将2×105个胶质瘤细胞接种于6孔板内，待50%～80%细胞融合后用Lipofectamine 2000转染，方法参照说明书。实验分为3组：对照细胞组（Control），反义序列组（Negtive control）及YAP敲低组（YAP siRNA）。

1.2.2 Western Blot分析 提取LN229细胞系的对照组、反义序列组和YAP敲低组蛋白，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，将凝胶上的蛋白转移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，进行蛋白免疫检测，一抗（YAP：1∶500；内参GAPDH：1∶1 000），二抗为山羊抗兔IgG（1∶1 000）分别孵育，抗原与抗体结合后应用化学发光分析仪LAS-4000扫描图像检测，计算蛋白表达量。

1.2.3 细胞增殖实验 采用噻唑蓝（MTT）比色法检测胶质瘤细胞的增殖能力。取对数生长期细胞接种于96孔板，每孔2×103个细胞/200 μL培养液，12 h后转染YAP siRNA及反义序列。分别于培养后24、48、72、96、120、144 h，每孔加入MTT 20 μL，避光孵育4 h后，弃上清液，每孔加入DMSO 200 μL，振荡10 min，使结晶物充分融解，用酶标仪490 nm波长测定各孔光吸收值结果，每组重复3孔。以对照组细胞的吸光度值为对照，求出其余两组的细胞增殖存活率。

1.2.4 细胞周期检测 75%乙醇、4℃固定消化好的单细胞悬液过夜，RNaseA 200 μL 37℃孵育30 min，与PI染色液800 μL混匀后4℃避光染色30 min，应用FACSCalibur（美国BD公司）流式细胞仪检测，激发波长488 nm，Modifit软件分析结果。

1.2.5 细胞侵袭（Transwell）实验 在Transwell上室中加入1：2（基底胶：DMEM）稀释后的基底胶50 μL，37℃30 min使聚合成凝胶。在下室中加入含10%胎牛血清的培养基500 μL。将用无胎牛血清培养基制备的细胞悬液200 μL（细胞密度5×105/mL）加入Transwell小室上室，常规培养24～48 h，弃上室液体，用湿棉签擦去膜上面的未穿膜细胞，4%多聚甲醛固定10 min，结晶紫染1～2 min，PBS清洗，DP-70倒置荧光相差显微镜（×100）采集图像，随机选取5个视野，计算穿过聚碳酸酯膜的细胞数。

1.2.6 细胞凋亡检测 用适量胰酶（0.125%）将转染后的细胞充分消化成单细胞悬液，磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，再用结合缓冲液500 μL重新悬浮细胞；加入AnnexinⅤ-APC 5 μL，混匀；室温、避光，反应5～15 min；633 nm激发波长检测荧光。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 Western Blot鉴定胶质瘤细胞中YAP敲低效果

实验采用GAPDH作为内对照，Western Blot分析证明转染YAP siRNA于胶质瘤细胞系LN229可显著下调YAP表达（图1）。

2.2 MTT方法检测敲低YAP对胶质瘤细胞增殖能力的影响

分别转染反义序列、YAP siRNA，转染YAP siRNA后24 h开始抑制细胞增殖，48～72 h抑制程度最明显，LN229细胞存活率为（60.0±3.5）%（P＜0.01），随后抑制能力减弱，但YAP敲低组细胞增殖仍低于对照组（图2）。

2.3 流式细胞术检测胶质瘤细胞不同处理组的细胞周期分布变化

YAP敲低组LN229细胞G0/G1期为（69.42± 0.83）%，对照组G0/G1期为（51.55±0.74）%，反义序列组G0/G1期为（51.59±0.58）%，故敲低LN229细胞中的YAP使细胞周期出现明显G0/G1期阻滞，从而延缓细胞周期进展（图3）。

2.4 Transwell实验检测敲低YAP对胶质瘤细胞侵袭能力的影响

人工计数5个随机视野内穿过聚碳酸酯膜细胞数，胶质瘤细胞LN229对照组、反义序列组及YAP敲低组分别为（220.00±6.00）个、（221.30±12.20）个和（61.33±4.16）个，YAP敲低组穿膜细胞数显著少于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01），提示下调细胞内YAP表达，可抑制肿瘤细胞的侵袭能力。

2.5 流式细胞术检测不同处理组细胞凋亡变化

YAP敲低组LN229细胞凋亡较对照组和反义序列组明显增多，其凋亡率为（18.80±1.03）%，与对照组（2.63±0.24）%和反义序列组（2.44±0.42）%比较，有显著性差异（P＜0.01），说明敲低肿瘤细胞内YAP的表达，可促进细胞凋亡。

2.6 Western Blot检测反映细胞生物学行为蛋白指标变化

YAP敲低组较对照组和反义序列组Ki-67、MMP-9、Cyclin D1和Bcl-2表达明显下调（图4）。

3 讨论

脑胶质瘤是最常见的颅内原发肿瘤，成人发病率为每年8/10万。尽管采取了手术、放疗和化疗等综合治疗措施，疗效仍较差，其平均生存率仍低于1年。脑胶质瘤本质上是一种多基因异常疾病，由于绝大多数原癌基因和抑癌基因属于信号转导通路中的重要组成成分，因此肿瘤细胞可以通过激活或增强一种和（或）多种原癌基因的表达以及发生抑癌基因的突变和（或）缺失，从而逃避正常生长机制的控制，使肿瘤细胞自主进行增殖和侵袭，从而出现恶性表型［5］。EGFR-PI3K-AKT通路、Ras通路、mTOR通路、Wnt通路、Notch通路均为与胶质瘤恶性进展密切相关的信号转导通路。至今对脑胶质瘤信号转导通路的作用及调节机制的认识还不完全，许多新的信号通路尚待进一步研究，以便为胶质瘤的治疗提供新的靶点。

Hippo信号转导通路首先在果蝇中被发现，其通过调节细胞增殖、凋亡，在胚胎发育以及器官形成过程中起着重要作用［6-7］。Hippo信号转导通路包括Mst1/2、Ww45、Lats1/2、Mob1、YAP、TAZ和Mer等成员，其中YAP基因是Hippo信号通路的核心成员［6］。如前所述，当Hippo通路激活时，YAP被磷酸化，不能进入细胞核，当Hippo通路被抑制时，YAP不能被磷酸化，则进入细胞核，调控其靶基因转录。YAP蛋白在正常组织和恶性肿瘤中的表达量存在明显差异，多数癌组织中的表达量较对照组明显升高，Su等［8］证明非小细胞肺癌，特别是肺腺癌早期出现YAP过表达，提示YAP的高表达可能是非小细胞肺癌生成的早期标志。Avruch等［9］研究表明YAP过表达可以促进结肠癌细胞增殖，提示YAP可能成为治疗结肠癌新的靶点。Wang等［10］研究发现，高表达YAP与单磷酸反应因子（CREB）相互作用共同促进肝癌的发生。Liu等［11］采用免疫组织化学法对213例膀胱癌标本的研究表明YAP在膀胱移行细胞癌中高表达，并可作为判断膀胱癌患者预后的独立指标。Xia等［12］研究结果显示YAP可以促进卵巢上皮细胞向间质演变，进而促使卵巢癌细胞生长和肿瘤的生成。但是在少数肿瘤中YAP还可能是抑癌基因，如Vlug等［13-14］研究发现敲低YAP后，乳腺肿瘤生长增加，促进迁移和侵袭，对化疗药物的反应下降，表明YAP在乳腺癌中起抑癌作用。

但是，关于YAP在人脑胶质瘤中表达的研究报道甚少。Orr等［15］对YAP在细胞核内表达水平的检测发现胶质母细胞瘤中YAP核内高表达，但YAP高表达较少见于毛细胞型星型细胞瘤，YAP高表达亦较少见于儿童胶质瘤患者。敲低YAP表达可抑制胶质瘤细胞增殖。本研究对LN229细胞转染YAP siRNA，敲低细胞中YAP蛋白的表达进一步观察对胶质瘤细胞生物学行为的影响。

本研究通过对转染YAP siRNA的胶质瘤细胞系LN229细胞进行细胞增殖、细胞周期时相分布、细胞生长、细胞侵袭以及凋亡检测，发现YAP对LN229胶质瘤细胞的上述生物学特性均有较为显著的影响［16］。敲低LN229细胞中YAP表达可以抑制肿瘤细胞增殖，阻滞细胞周期于G0/G1期，抑制肿瘤细胞的侵袭能力，促进凋亡。同时，敲低YAP表达后，作为与增殖相关的指标Ki-67、与侵袭相关的指标MMP-9、与周期相关的指标CyclinD1以及反应凋亡的指标Bcl-2表达明显下调，提示YAP通路对胶质瘤生物学行为具有重要调控作用，Hippo信号通路为胶质瘤相关信号转导通路。YAP对胶质瘤生物学行为调控机制的分子研究有待于继续深入研究；YAP是否与其对靶基因的转录调控有关、Hippo-YAP通路其他基因在胶质瘤中的变化及其与胶质瘤其他重要信号通路之间的联系等问题，尚需进一步探究。

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（2014-02-18收稿）

（2014-05-12修回）

（本文编辑：邢颖）

Yes-associated protein modulation of human glioma cell growth in vitro

Fuhua YU,Zhifan JIA,Peiyu PU,Guangxiu WANG,Anling ZHANG,Weidong YANG
Correspondence to:Weidong YANG;E-mail:yangweidongshine@sina.com

Laboratory of Neuro-Oncology of Tianjin Neurological Institute,Department of Neurosurgery,Tianjin Medical University General Hospital,Tianjin 300052,China

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China(Grant No.30872985)

Objective:This study aimed to explore the effect of Yes-associated protein(YAP)on the growth of the human glioma cell line LN229.Methods:YAPsiRNA was transfected into LN229 cells to knock down the YAP expression.The downregulation of the YAP expression was identified through Western Blot analysis.Colorimetric assay using methyl-thiazolyl-tetrazolium was applied to evaluate cell proliferation ability.Cell invasive activity was examined using Transwell assay.Flow cytometry and AnnexinV were used to detect cell cycle and apoptosis,respectively.The relevant molecules regulating proliferation,invasion,cell cycle progression,and apoptosis were examined through Western Blot analysis.Results:The YAP expression was downregulated after YAPsiRNA was transfected into LN229 glioma cells.Reduced YAP expression could arrest the cell cycle at G0/G1 phase,inhibit cell proliferation and invasion,and promote apoptosis.The expression of the proliferating cell nuclear antigen(Ki-67),matrix metallopeptidase-9(MMP-9),cyclin D1,and Bcl-2 were downregulated.Conclusion:The downregulation of YAP in LN229 cells suppresses cell proliferation and invasion,as well as promotes cell apoptosis.This study provides a novel evidence for further study on Hippo-YAP signal pathway in molecular pathology of glioma.

glioma,YAP,Hippo signal pathway,apoptosis,invasion

10.3969/j.issn.1000-8179.20140237

于福华 硕士研究生。研究方向为胶质瘤的基础研究。

天津医科大学总医院神经病学研究所神经肿瘤室（天津市300052）

*本文课题受国家自然科学基金项目（编号：30872985）资助

杨卫东 yangweidongshine@sina.com

E-mail：yufuhuajiangjiang@126.com