肠道特异性保护因子GLP－2的研究进展1）

常鸿菲，冷雪芹

1 GLP－2的生物学特性

胰高血糖素原（PG）基因主要表达于哺乳动物胰腺α细胞和肠道L细胞内，其表达产物经过不同的翻译加工修饰过程，生成不同的肽类产物。在胰腺经激素原转化酶（PC）完成翻译后加工修饰过程后生成的是胰高血糖素，在肠道经PC1／3翻译加工修饰则产生胰高血糖素原衍生肽（PGDP）。GLP－2 即是PGDP 家族的成员之一，它是一条由33 个氨基酸残基组成的单链多肽［1］。GLP－2主 要 分 子 形 式 有2 种：有 活 性 的GLP－2－（1－33）和无活性的GLP－2－（3－33）［2］。两种生物半衰期较短，在人体分别约为7min和27min，GLP－2的半衰期较其降解产物要短得多，因此在循环中GLP－2的浓度仅为其降解产物的一半。GLP－2的分泌主要因素是肠道营养物质的摄入，尤其是碳水化合物和脂类，同时还受到神经、内分泌和免疫等多种因素的调节［3］。碳水化合物和脂肪是有效的GLP－2分泌刺激物，蛋白几乎没有刺激作用。液体食物比固体食物的作用好，但营养摄入的频率并不影响GLP－2的分泌［3］。据报道［4］，体外直接向小鼠盲肠灌注混合脂肪酸可刺激L细胞分泌GLP－2，而且多不饱和脂肪酸的刺激作用更强。这可能与L 细胞含有的肠道脂肪酸结合蛋白同分异构体以及蛋白激酶C（PKC）传递脂肪酸信号有关［5］。一种肠道近端K 细胞分泌的GIP，通过迷走神经途径促进胃泌素释放肽（GRP）生成，进而刺激L 细胞分泌GLP－2［6］。GLP－2的代谢主要通过肾脏清除和二酰肽肽酶Ⅳ（DPP－Ⅳ）的降解［7］，机体二酰肽肽酶Ⅳ（DPPⅣ）的活性和肾功能状况是影响GLP－2代谢水平的重要因素。DPPⅣ是一种表达在肠道和血管内皮的常见蛋白酶，GLP－2 氨基末端第2位的丙氨酸则是DPPⅣ的理想底物。完整的GLP－2，即GLP－2（1－33），经DPPⅣ水解氨基末端前两个氨基酸残基后形成的GLP－2（3－33），则GLP－2失去生物学活性。在体外，DPPⅣ与GLP－2 孵育生成失活的GLP－2（3－33），而在体内和体外DPP－Ⅳ的抑制物均能防止GLP－2 的降解。GIP－2R是G 蛋白偶联受体，主要分布于回肠和结肠内分泌细胞、肠上皮细胞和肠神经元细胞。GIP－2R 仅仅能与GIP－2相结合。食管与肝无GLP－2R 表达；而胃、小肠（空肠）与大肠（结肠）有GLP－2R表达［8］。

2 GLP－2的生物学作用

2.1 调节胃肠道摄食 血液中高水平的活性GLP－2可促进肠道上表皮细胞对葡萄糖的摄入能力，据研究证明GLP－2可增加肠道刷状缘膜中葡萄糖转运载体1 和葡萄糖转运蛋白2 的表达［2］。与此同时，GLP－2也可以改变肠道基底膜对葡萄糖的转运能力。GLP－2还上调空肠葡萄糖转运蛋白5的表达［9］。健康人摄食后体内GLP－2 的血浆水平明显升高，但生理水平的GLP－2对食欲和能量摄取无明显影响，外周给予GLP－2不影响健康志愿者的摄食。但也有研究发现GLP－2能抑制人类ghrelin的分泌来影响人的摄食活动。GLP－2大鼠侧脑室插管灌注可以抑制摄食，同时发现视丘下部有GLP－2R 的表达，推测GLP－2可能是摄食中枢的神经递质。GLP－1受体基因敲除小鼠脑室灌注GLP－2可明显抑制摄食［10］。车炼强等［11］研究证明免疫应激导致的GLP－2分泌下降主要受免疫应激本身的效应影响。

2.2 促进肠道的成熟与发育 据报道［12］，给大鼠注射入GLP－2（hGLP－2）及 猪GLP－2（pGLP－2）均 能 使 小 肠 的 重 量 和 长 度 增加，近端回肠的横截面积增加。提示GLP－2 可能对胃肠道的发育和成熟有一定作用。Petersen 等［13］发现，在胎儿和新生期的仔猪肠道检测到GLP－2 受体的mRNA 转录子。Orskov 等［14］给大鼠分别注射GLP－2、GLP－2角质细胞生长因子（KGF）抗体发现，KGF 抗体消除了GLP－2 对大肠的促生长效应。Burri等［15］给新生仔猪注射GLP－2 后发现小肠重量增加，肠黏膜组织DNA 和蛋白含量增加，肠绒毛增长，且剂量越高，效果越好，这表明GLP－2的作用效果与剂量有关。

2.3 GLP－2 与受损伤肠道修复GLP－2 的作用体现在刺激肠黏膜隐窝细胞的增殖和抑制与其凋亡，从而促进肠黏膜的生长及损伤后的再生修复。陈霞等［16］研究显示给予GLP－2治疗后，SPA 大鼠小肠黏膜损伤显著减轻，黏膜轻度水肿，绒毛较长数量较多，上皮细胞基本，断裂现象不明显，绒毛固有层淋巴细胞、浆细胞等免疫细胞数量较多。提示GLP－2可以有效减轻小肠黏膜的损伤，减轻炎症改变，恢复小肠绒毛，小肠腺形态结构完整及肠上皮结构的完整。赵希敏等［17］研究发现，大鼠弥漫性脑损伤后肠道黏膜的特异性和非特异性免疫均受损，GLP－2改善了颅脑外伤大鼠肠黏膜的特异性免疫和机械免疫（非特异性免疫），阻止细菌易位减轻了颅脑外伤时的内毒血症。葛鹏磊等［18］通过结扎大鼠胆总管制造的肠道菌群移位模型中，模型组和GLP－2治疗组门静脉血中内毒素含量均随时间的延长而逐渐增加，但GLP－2治疗组的内毒素含量在各时间点上均明显低于模型组（P＜0.05）。提示GLP－2对胆总管结扎大鼠肠道细菌移位和内毒素血症具有抑制作用，从而保护肠道屏障功能。对大鼠腹腔注射LPS（5 mg／kg）制造的脓毒症大鼠模型显示：微绒毛变细、变疏、排列紊乱，部分断裂、脱落；线粒体严重肿胀，嵴肿胀、断裂甚至消失，呈空泡变性，粗面内质网扩张上皮细胞紧密连接增宽。应用GLP－2后，肠黏膜形态学及分子生物学水平均发生了显著改变，表现为明显减轻了肠道细胞损伤程度，使细胞器和细胞间紧密连接的损伤较实验组减轻，免疫组化和western blot结果occludin表达较实验组明显增加。而所有这些的直接结果是使肠黏膜通透性降低，细菌移位率下降。说明GLP－2可以降低肠道屏障功能损伤的程度，减少细菌移位率，对脓毒症的肠道损伤有一定保护作用［19］。小肠黏膜发生严重淤血及再灌注损伤，可以导致肠道黏膜屏障功能的损害，肠道内细菌穿过肠上皮细胞侵入，细菌内毒素也能通过异常的上皮屏障进入血液循环，形成肠源性感染。朱亮等［20］采用无创显微血管夹夹闭肠系膜上动脉20 min的方法制造淤血－再灌注损伤模型，GLP－2组造模前经GLP－2 处理，250mg／kg，2次／日皮下注射，连续给3d。组织学观察GLP－2组肠黏膜绒毛高度，隐窝深度显著高于淤血－再灌注组。电镜观察GLP－2 组微绒毛较整齐，单位横断面上的微绒毛数目较多，且较长，上皮细胞间紧密连接、线粒体形态基本正常；淤血－再灌注组微绒毛排列紊乱、高度明显低于GLP－2组，上皮细胞间紧密连接增宽、部分线粒体程空泡状变性。提示外源性GLP－2 减轻小肠淤血－再灌注损伤。对烧伤大鼠肠黏膜的研究中发现补充外源性GLP－2可降低烧伤后肠黏膜细胞凋亡，维护肠黏膜功能，其可能系通过降低Caspase－3活性、增加Bcl－2表达来抑制凋亡。此外，GLP－2能对大量临床前表现的肠损伤产生治疗作用，包括化疗引起的黏膜炎、炎症性肠病的动物模型。

2.4 GLP－2 与肠道酶活性 肠外营养下用GLP－2处理新生仔猪，可增加麦芽糖－葡萄糖化酶（MGA）和蔗糖－异麦芽糖酶（SI）mRNA 表达及其酶活性，静脉灌注GLP－2刺激了猪胎儿氨基肽酶N（AmN）mRNA 表达及其活性［21］。加入hGLP－2培养细胞96h后，28日龄断奶仔猪肠上皮细胞已具备单层柱状上皮细胞的典型特征［9］，各试验组细胞数量均显著多于对照组（P＜0.05）；各试验组培养液乳酸浓度、总蛋白含量和蛋白质沉积量都显著高于对照组（P ＜0.05）；各试验组的胞外碱性磷酸酶、乳酸脱氢酶和肌酸激酶活力都极显著低于对照组（P＜0.01）。GLP－2可以促进体外培养断奶仔猪小肠黏膜上皮细胞增殖，提高酶的活性，抑制细胞凋亡，维持细胞形态的完整性［22］。GLP－2可促进移植肠黏膜双糖酶活性的恢复，GLP－2 促进移植肠黏膜Na＋－K＋ATP 酶活性恢复，促进血清D－木糖水平提前恢复至正常水平［23］。GLP－2 影响肠道消化酶的机制目前还不很清楚，推测GLP－2 增加肠道酶活性可能与肠道上皮组织的生长发育状况有关。肠道绒毛、隐窝等结构的完整性是肠道刷状缘正常功能的基础［24］。

3 GLP－2的作用机制

GLP－2可能通过多条途径最终促进正常肠黏膜的生长和病理肠黏膜的恢复。一方面GLP－2通过分布于肠上皮细胞GLP－2R 直接促进肠上皮细胞的增殖，抑制其凋亡［25］。另一方面GLP－2通过分布于肠内其他部位的GLP－2R间接发挥保护肠道细胞、促进肠功能恢复的作用［26］。Koehler等［27］利用Hela细胞分析GLP－2R 信号转导发现，GLP－2激活Ras／MAPK 途径，并且GLP－2刺激的ERK1和ERK2的激活至少部分由p亚基所介导。Jasleen等［28］用Caco－2细胞模型研究表明，在酪氨酸激 酶、PI－3K 和MAPK 三 条 信 号 转 导 通 路 中，GLP－2通 过 激 活ERK1和ERK2途径，促进肠上皮细胞的增殖，并可通过增加细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白E 和细胞周期蛋A（cyclins D1、E、A）的表达来发挥协同作用。Yusta等［29］还测得GLP－2抑制BHK－GLP－2R细胞中ERK1和ERK2的活性，在磷脂酰肌醇－3－激酶（PI3K）抑制剂LY294002和ERK 抑制剂PD98059存在的条 件 下， GLP－2 作 用 不 能 被 阻断。另一方面，GLP－2可抑制放线菌酮诱导的BHK－GLP－2R细胞的凋亡，通过减少线粒体细胞色素C 释放，减少原癌基因Bax的表达，抑制了半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白－3（caspase－3）、caspase－8、caspase－9酶活性，减 少DNA 断 裂、提 高 细 胞 的 存 活率，这证明GLP－2抑制了线粒体途径的细胞凋亡。以上3种模型对于GLP－2生物学功能的研究，其结果有矛盾之处，这是细胞模型的缺陷所致，因为GLP－2具有组织特异性，对于肠道细胞的保护作用极其明显，而BHK 细胞和Hela细胞均不是肠道来源的细胞，Caco－2细胞虽然是肠上皮细胞，但细胞本身并不表达GLP－2R。因此，对于GLP－2生物学功能最好的研究模型应该是肠道细胞且能表达GLP－2R，才能真正揭示GLP－2的分子作用机制。目前表达内源性GLP－2R的肠上皮细胞还未分离，肠上皮原代培养可能是最好的选择，这还需要以后进一步研究、探讨。GLP－2通过肠道广泛分布的GLP－2R，直接或间接地发挥促进肠上皮增殖、抑制肠上皮凋亡、增加肠道血供、抑制胃排空和胃酸分泌、促进肠黏膜吸收功能和屏障功能改善等多方面的生物学功能。

4 GLP－2与结肠息肉及肿瘤的关系

国内外关于GLP－2与结肠息肉及肿瘤的相关研究较少，国外许多研究只是基于结肠癌细胞株和动物实验。Masur等［30］发现10nM GLP－2 使HT29 细胞的迁移率从11.4%增加至18.7%，HT29细胞的倍增时间从1.1d减少至0.94d。整体实验中，Koehler等［31］完成的一项最新研究表明，无论是体外培养的转染GLP－2 受体的DLD－1、SW480 和HT29 细胞株，还是将上述细胞株移植到裸鼠体内，外源性GLP－2 均不会刺激其生长，而且给予外源性GLP－2连续7周，未影响Apc小鼠肠道息肉的大小和数量。Lakoubov等［32］认为长期应用GLP－2治疗可引起结肠癌的发生，而拮抗GLP－2R 可减少发育异常。在给予小鼠甲基化致癌物1，2－二甲肼处理之前，长期给予Teduglutide可明显促进大的结肠新生物的发生。而当给予全胃肠外营养支持的荷瘤大鼠GLP－2时，肿瘤的大小或生长无变化。

5 结 语

目前GLP－2对小肠、结肠黏膜上皮的促细胞生长、营养吸收、抑制凋亡等作用已得到大量的动物实验支持。虽然尚无临床试验数据，但其在动物实验中所显示对肠道作用的特异性、对于肠黏膜损伤的修复、肠屏障功能的增强使其在炎性肠病的治疗中具有广阔的应用前景。GLP－2作为一种肠上皮特异性生长因子，有强大的促进损伤肠上皮恢复的作用，且强于其他非特异性肠上皮生长因子，这些优点显示了GLP－2良好的临床应用前景。然而，GLP－2强大的特异性促肠生长特性，是否也有可能促进肠道肿瘤的发生和已有肠道肿瘤的生长和转移，这对于GLP－2的临床应用（特别是长期使用）和患者的选择至关重要，相关研究很少，也是今后基础和临床研究需共同解决的问题。

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