胚胎干细胞衍生的视网膜色素上皮细胞移植治疗眼病

胡诞宁

2012年Schwartz等[1]在Lancet上发表论文，报告用人胚胎干细胞 (human embryonic stem cell,hESC)分化而来的的视网膜色素上皮细胞 (retinal pigment epithelium,RPE)移植治疗年龄相关性黄斑变性 (age-related macular degeneration,AMD) 与Stargadt黄斑营养不良各一例获得成功 。这是应用hESC分化而来的细胞作临床移植取得成功的首次报告,对细胞移植与干细胞的临床应用都具有重要意义。本文复习有关文献，对RPE移植的适应证、取材、疗效；hESC分化而成的RPE(hESC-RPE)的实验研究以及临床移植的效果及存在问题等进行讨论，并展望了hESC-RPE移植的前景。

一、RPE功能及有关疾病

RPE是介于脉络膜与神经视网膜之间的单层色素上皮细胞，具有很多重要功能，如吞噬感光细胞外节、维生素A代谢、水与离子输送、合成有黏合作用的细胞外基质、黑色素的遮光、抗氧化作用以及制造生长因子、细胞因子、神经营养因子等。RPE的受损可造成视网膜(尤其是感光细胞)和脉络膜的损害，严重影响视功能。应用RPE移植，可能有助于修复及重建功能[1]。

RPE的损害可引起多种眼病，包括AMD和几种遗传性视网膜病等。其中AMD是老年人致盲主要原因之一，可分干型与湿型两型，干型主要是黄斑区RPE和感光细胞的损害，RPE的病损又是导致感光细胞受损的重要环节。如能将正常的RPE植入视网膜下，有可能保护残留的感光细胞和视力。湿型是由于视网膜下有新生血管形成，进而导致黄斑水肿与出血，如通过手术切除视网膜下新生血管膜，常损及残存的RPE，引起术后视力下降，如在手术时同时作RPE移植，应有可能保存视力。因此RPE移植具有重要的临床意义[2-4]。

二、RPE移植治疗眼病的现况

应用hESC分化而来的RPE（hESC-RPE）移植治疗眼病是在RPE移植的基础上发展而成的。其适应证、移植方法、疗效、并发症以及免疫排斥反应与RPE移植有不可分割的联系。不了解RPE移植的效果与存在问题，就无法理解hESC-RPE移植的价值与意义。因此就RPE移植治病眼病的现况作一简短复习。

人眼RPE的分离培养与体外研究方法是Gouras(Columbia大学)与笔者(Johns Hopkins University)在二十世纪80年代初分别建立的[5-6]。经过30多年的发展，人类RPE的细胞培养技术己较成熟。在技术熟练的实验室，RPE在体外培养中可分裂20～30次或更多(扩增100万～10亿倍)。因此从尸体眼球取得RPE，进行细胞培养扩增并无困难，为RPE移植奠定了基础。

Peyman(1991)首先对2例湿型AMD手术切除网膜下新生血管膜后作了RPE移植[7]。根据供材来源可分为自体或异体移植，各有其优缺点。

三、异体RPE移植

由于RPE在视网膜之下，难以从自体取得，因此开始时多为异体移植，取自胎儿或成年人尸体眼球，经或不经培养后植入RPE缺失区的视网膜下腔[2-4，7-8]。

美国的Gouras与瑞典眼科学家合作，做了较多例RPE移植，将来自胎儿的RPE培养后取下，接种至黄斑区，治疗对象为干型或湿型AMD。原先估计视网膜下腔为免疫赦免区，对异体RPE不会发生排斥反应，但术后湿性患者全部在三个月内发生排斥反应，表现移植区荧光渗漏及黄斑水肿和视力降低，可能由于湿型已有血—视网膜屏障破坏，易发生排斥反应[2]。(hESC-RPE移植研究避开了湿型病例,即基于此)。干型患者术后半年内尚无不良反应，但较长时间观察后也有部分患者发生排斥反应，与移植的细胞量有关 (详见hESC-RPE移植存在问题 )[2，4，8]。基于该组的教训，异体 RPE 移植已较少施行，直到hESC-RPE研发成功，才重新试用异体细胞于干型患者。

四、自体RPE移植

由于异体RPE移植易有排斥反应，近10年内报告的RPE基本上均为自体RPE移植[9-13]。通常用于湿型AMD，手术切除视网膜下新生血管膜时同时作RPE移植。供材来自同一眼非黄斑区部位，切开视网膜后切下小片帶有脉络膜的RPE，直接移植至切除新生血管膜区的视网膜下。本法已有较多报告，术后均无排斥反应，但手术并发症很多，包括视网膜脱离，出血，增殖性玻璃体视网膜病等。严重损害视力[9-13]，这可能与手术损伤有关。此外，RPE移送过程中只要有少量细胞脱落于玻璃体腔内，即可能引起增殖性玻璃体视网膜病[9-13]。

五、自体虹膜色素上皮细胞(IPE) 移植

由于自体RPE移植并发症多，异体RPE移植又有排斥反应，因此亟需另辟途径。IPE与RPE胚胎上为同一来源，如能具有同样功能，则有可能用IPE代替缺损的RPE。作者在1992年建立了人类IPE的分离培养方法[14]，此后又创建了从小片虹膜切除标本作分离培养的技术[14]。目前应用此方法，在技术熟练的实验室均能分离培养IPE，满足移植的要求。经体外培养及动物实验，在己测试的RPE功能中，如吞噬功能、维生素A代谢、黑色素作用、以及制造生长因子、细胞因子、神经营养因子等方面。IPE都能具有类似RPE的功能。遗传性RPE缺陷的鼠作IPE移植。可防止或延缓视网膜变性的发生[16-19]。

手术时对湿型AMD切除视网膜下新生血管膜后，将取自患者自身虹膜切除术标本经过体外培养扩增后，注入视网膜下腔。如RPE缺损区较小，IPE也可不经培养，直接进行接种[20-24]。至今在西欧和日本己有五组临床报告，施术百例左右，移植后一般无排斥反应或其他并发症，安全无害。术后能保存视功能，视力等于或稍优于术前[20-24]。

六、hESC-RPE移植的意义

由上可见，对湿型AMD自体RPE移植并发症很多，异体RPE移植必被排斥，自体IPE移植较安全。近年由于抗VEGF药物治疗湿型AMD有较好疗效，手术切除新生血管膜及细胞移植已无必要。对干型AMD，RPE移植仍有需求，但一般不敢轻试自体RPE移植，异体RPE移植又可能发生免疫排斥。

用ESC分化的细胞种类，最有价值的应是不易从尸体分离培养得到的细胞，如胰岛细胞等，而分离培养尸体RPE毫无困难。异体RPE移植的困难不在于供材而在于免疫排斥。hESC分化来的RPE必是异体RPE，似无根本性改进。因此，做hESC-RPE移植看来似乎逆理。很可能研究者目的在于利用RPE移植己积累的丰富经验与知识，探索用hESC分化来的细胞作临床移植的可能性，更胜过解决对某一眼病治疗的实际需要。

七、从ESC定向分化为RPE的体外及动物试验

近年来已有较多报告，应用各种药物在体外促使ESC定向分化为RPE取得成功，将hESC-RPE移植至实验动物的视网膜下腔后RPE能存活，表达一定功能，亦未发生肿瘤等并发症[25-33]。移植方法可以是将细胞悬液注入视网膜下腔，也可以是将贴有单层RPE的载体放入视网膜下[31-32]。以上试验为hESC-RPE的临床应用奠定了基础。

在鉴定ESC定向分化为RPE是否为完全分化，具有全部功能的正常RPE时，早期仅检测几种功能，例如吞噬功能、制造黑色素、维生素A代谢、极性和屏障功能等，应用的方法有免疫组化和western blot等[25，30-33]。但具有几种RPE功能的细胞不等于具有全部功能。常态下能生存的细胞不等于在环境因素改变时能具有正常的应变功能。近年的进展是对正常或定向分化所得的RPE作全面的基因转录检测，进行比取，从而判断其功能。例如Liao等[34]对人胚胎RPE，hESC-RPE，从iPSC分化来的RPE，未分化ESC，成纤维细胞等作了检测，发现在87个RPE标志性基因的表达上，从ESC或iPSC分化来的RPE与人胚胎RPE大体相似。但有21个基因仅表达于正常胚胎RPE，而不见于hESC-RPE。这些表达差异的基因，主要是与眼，特别是晶状体的发育有关。我国同济大学医学院更检测了从正常RPE和hESC-RPE的miRNA的表达谱，认为亦有助于hESC-RPE的鉴定[35]。

八、用hESC-RPE移植治疗视网膜疾病的临床报告

美国加州大学洛杉矶分校眼科的Schwartz等[1]报告了用hESC-RPE移植治疗AMD与Stargadt黄斑营养不良各1例。细胞系由Advanced Cell Technology公司供应，来自hESC-MA09细胞株，能表达RPE65、bestrophin、MITF、Zo-1、PAX6等；黑色素含量4.1 pg/细胞，系99﹪纯的RPE，不含hESC。体外试验发现色素含量少的细胞(较年轻的细胞)存活与生长都较色素含量多的细胞好。动物试验中接种至裸鼠视网膜下能整合入宿主组织，未形成肿瘤[1]。临床移植时将含50000个细胞的150μl细胞悬液用結核菌素针筒注入黄斑区视网膜下腔。术前一周开始使用小剂量免疫抑制剂，12周后停药。术后见到注射区的视网膜在数小时后即告平伏，观察至术后4月，未发生细胞增殖，逸出移植区，眼内炎症，肿瘤形成或免疫排斥。两例均为晚期患者，视力均有轻度改善[1]。Schwartz等[1]认为hESC-RPE的优点是可以提供无限量的较年轻的RPE，且认为从ESC分化而得的细胞可能较少发生免疫排斥。

九、用hESC-RPE移植治疗视网膜疾病的进展及现况

该项研究是由Advanced Cell Technology公司组织的临床试验(Phase1/2)，从2011年4月28日至2014年1月。计划用hESC-RPE移植治疗干型AMD与Stargadt黄斑营养不良。进行移植的单位除加州大学外还有Johns Hopkins大学，Wills眼科医院，Moorefield眼科医院等。计划中按移植细胞量分 4期，分别为 50000，100000，150000，200000细胞/眼。Schwartz报告的是最初的二例[1]。据该公司2013年11月12日最后公布的资料，己移植了30例，第3期(150000细胞/眼)已结束，所有各例未见不良反应[36]。但迄今尚未见到第二篇学术报告发表。在未见新的学术论文发表前，对其评价也只能以已发表的第一篇报告为准[1]。

十、评论

用hESC-RPE移植治疗视网膜疾病的初步成功，是第一次将hESC定向分化的细胞移植至人体治疗疾病的报告，无疑具有重大意义。但从已有资料看也还存在一些待深入研究的问题：

1.免疫排斥：过去异体RPE移植治疗干型AMD失败的主要原因为延迟发生的免疫排斥，免疫排斥与移植细胞量有关。移植20000细胞/眼的未发生排斥，50000细胞/眼的在8～12个月才发生免疫排斥[4，8]。而本组(亦为50000细胞/眼)观察期仅 4 月，还未到免疫排斥发生的期限[1，4，8]。因此尽管该文作者认为从ESC分化而得的细胞可能较少发生免疫排斥，但毕竟也还是异体细胞，究竟是否会发生免疫排斥，还有待更长时间的观察才能断定。同时，异体RPE移植的经验，移植细胞达500000细胞/眼的免疫排斥更严重，发生也更早[4，8]。因此对本组中移植细胞量较多的 (150000～200000细胞/眼)更应注意。

2.功能改变：hESC-RPE毕竟是实验室中从hESC分化而得的RPE，是否能具有正常已分化的RPE的全部功能，对环境因素能否具有正常的应变功能，能否长期的保护感光细胞及维持视功能，也还有待观察[34]。需注意的是根据大组基因转录的检测，在正常RPE的87个标志性基因中，hESC-RPE只具其中约3/4的基因表达，还有21个基因表达异于正常胚胎RPE，这些差异可能引起的临床改变，也值得密切监测[34]。

3.笔者认为hESC-RPE是较年轻的细胞，具有较好活力，为其优点。但以往报告的异体RPE移植用的是胚胎RPE，因此这一优点并不存在。以目前RPE的培养水平，提供大量年轻的正常RPE，并非难事，似无需从hESC分化取得。

4.对RPE和hESC-RPE移植前景展望：（1）AMD是与年龄相关的慢性进行性疾病，病因未除去前，移植的RPE仍可能发生病损[4]；（2）RPE本身并无视功能，只能通过维护感光细胞间接影响视功能，同时也不可能使己死亡的感光细胞再生，至多能使濒临死亡，功能丧失或降低的感光细胞恢复部分功能，因此对移植后的视功能进步，不能奢求，如能结合基因工程，增加神经营养因子的分泌，当有裨益[37]，目前感光细胞移植在实验动物已取得成功[38-39]，因此先用RPE或hESC-RPE移植改善基地，随之以感光细胞移植，才有可能大幅度改善视功能；（3）从应用的RPE种类看，如能用从患者自身取得的iPSC或成体干细胞分化成的自体RPE(目前用iPSC分化RPE，在体外及动物试验，均已成功[40-41])对解决免疫排斥，可能更为有利。

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