多能干细胞分化来源视网膜色素上皮细胞移植治疗视网膜变性研究进展

邓雯丽 向萍 金子兵

•综述•

多能干细胞分化来源视网膜色素上皮细胞移植治疗视网膜变性研究进展

邓雯丽 向萍 金子兵

视网膜色素上皮（RPE）对视觉功能的维持起着至关重要的作用。视网膜变性是全球不可治愈性致盲疾病的重要原因，它由视网膜色素上皮功能失常所引起。因此，视网膜色素上皮移植是视网膜变性患者恢复视力的一种最有前景的手段之一。随着干细胞技术的快速发展，从多能干细胞(PSC)到有功能的视网膜色素上皮细胞的体外分化诱导技术已经成熟，其中包括胚胎干细胞（ESCs）和诱导多能干细胞(iPSCs)等。此外，从患者特异性iPSCs分化而来的RPE更能用于阐明发病机理并有针对性地个体治疗。更值得一提的是，经诱导得到RPE的移植不论在动物模型中，还是在临床试验里都已经得到了可喜的治疗效果。本文回顾PSC来源RPE干预治疗视网膜变性的最新研究进展。

色素上皮，眼；胚胎干细胞；多潜能干细胞；视网膜变性；干细胞移植

视网膜是中枢神经系统的一个重要部分，在视力的产生，视觉信号的处理中起着关键作用。视网膜色素上皮位于神经视网膜的外层，由单层色素上皮细胞组成，其主要作用为滋养感光细胞，应答不同的细胞外信号，吸收分散光线，视网膜视觉周期异构化，分泌神经营养因子吞噬感光细胞外节层，并作为血—视网膜屏障中的紧密连接部分[1-3]。视网膜色素上皮(retinal pigmented epithelial,RPE)的缺失和功能失常是导致视网膜变性疾病的主要病因，包括年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration,AMD）、遗传性视网膜变性——视网膜色素变性（retinitis pigmentosa,RP）以及Stargardt病。这些都是世界范围内不可治愈性致盲疾病，遗憾的是目前仍未有根本措施能减缓这些疾病的进程，并恢复丧失视力。截止到现在，在视网膜变性治疗的道路上已有很多人贡献了自己的力量。如今，细胞移植技术是填充和置换变性受损RPE的治疗策略中最有前景的一种，如其能正确整合入现存受损细胞网络，将为治愈视网膜变性带来希望。在此之前，各型RPE细胞，包括同源同体和同种异体RPE、胚胎RPE、自发人类RPE永生细胞系ARPE-19和同源同体的虹膜色素上皮等都已被用来作为移植的细胞来源。然而，遗传易感性和移植材料的缺乏极大地限制了进一步移植的进程。

多能干细胞（pluripotent stem cells,PSCs)，包括胚胎干细胞（embryonic stem cell,ESCs）和诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs），无论从分子还是功能上都具备与体内的PRE细胞相同的分化潜能[4-6]。更重要的是，在黄斑变性的老鼠等动物模型中已有足够的证据说明，人类胚胎干细胞（human embroynic stem cells,hESCs）来源的RPE细胞移植能挽救感光细胞并阻止视力的进一步丢失[7-8]。2012年Schwartz等[9]报道了hESCs来源的RPE细胞能成功地移植到严重的视网膜变性疾病中。虽然关于hESCs与iPSCs的争论从未停止，但它们都有类似的优点，即个性化治疗视网膜变性疾病。在本文中，将总结基于多能干细胞的发展现状，概括出分化RPE细胞的不同方法，并讨论支持与运输RPE细胞的支架。

一、多能干细胞（PSCs)

PSCs是一类拥有无限增殖潜能和分化为身体任意胚层（外胚层、中胚层、内胚层）能力的细胞。PSCs由ESCs与iPSCs组成。

Thomson以及同事成功建立了人类ESCs细胞系[10]，这激起了科学领域与社会大众的广泛兴趣，利用其在细胞治疗上的潜能可以在体外建立疾病模型，因为这样的干细胞系能避开人类干细胞来源的缺乏问题。

iPSCs是从无干性的成体细胞如表皮细胞，通过四个转录因子（Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc）的异位表达诱导而来，此方法最早在2006年由Takahashi和Yamanaka[11]在小鼠模型中建立。一年后他们[12]以及另一实验小组成功将成人表皮成纤维细胞重编程为多潜能性，并证实这种hiPSCs在形态、增殖、表面抗原、基因表达、干细胞特异性状态与端粒酶活性等与hESCs相同[13]。截止到现在，iPSCs在针对不同细胞类型，各种转录因子，不同的方法[14]上仍在探索中，其最主要的关注点是更高效，非整合，以及个体化。初始的iPSCs系相对于ES样的克隆效率低。而如今，很多团队都已经报道通过各种方法增强iPSCs的分化效率，如：优化培养环境[15-16]、降低氧浓度[17]，加入丙戊酸（组蛋白脱乙酰酶抑制剂）[18]、锂[19]、维生素C[20]等小分子化合物。原始的iPSCs由四个关键转录因子经病毒载体转染而产生，因此，各种对于基因组的转基因整合将导致人为的突变也限制了iPSCs的运用。紧接着，非整合性的策略显示了其安全性，通过质粒[21-22]或者定点整合的腺相关病毒[23]、泡沫病毒[24]、仙台病毒[25]、PiggyBac（PB）转座子[26]、mRNA[27]、重组蛋白[28]以及化合物[29]替代了早期病毒载体。与ESCs相比较，iPSCs能较轻易地将患者的体细胞重编程为特异性的iPSCs，它拥有与相同白细胞抗原的同源同体干细胞治疗方法的不竭来源[30-31]。总而言之，通过非整合方法能高效地形成安全并个体化的iPSCs已逐渐成为可能。

二、RPE细胞的来源

在过去十年中，很多小组已经持续深入地在体外从PSCs分化为RPE进行了研究，下面将详述细节。

1.基质细胞共培养：2002年Kawasaki等[32]第一次通过猴ES细胞系与基质细胞系PA6共培养能够分化出RPE样的细胞。在培养3周后，拥有的大片色素细胞不但呈现六边形而且标记物Pax6呈阳性，这在大约10﹪的早期ES克隆中能见到。两年后，他们小组又报道了培养出的RPE细胞不仅表达典型的RPE标记物：ZO-1、RPE65、CRALBP和Mertk等，而且拥有广泛的微绒毛能吞噬乳胶微粒。令人欣喜的是，对于RPE功能障碍的经典模型鼠（royal college of surgeons rats，RCS）的RPE细胞视网膜下移植，于8周后展现出在保存视功能上的重要改善。2012年Okamoto等[33]发表了关于用食蟹猴的腹部皮肤在PA6的滋养层上（被定义为标准的SDIA法）或者在PA6上清中（改良的SDIA法）培养均能分化出RPE样细胞。然而，笔者对于PA6培养基到底是提供了一个适合诱导的RPE细胞分化的环境，亦或是直接促成了其诱导，这其中的分子机制仍不甚清楚。

2.自发分化：自发分化的方案最早由Klimanskaya等建立。他们让hESCs首先生长过度并层叠覆盖后，在缺乏碱性成纤维生长因子（bFGF）的培养基中能被诱导自由分化为类似RPE细胞[34]。这种合成的RPE样细胞在基因表达谱上更接近人类胚胎RPE细胞而非RPE细胞系，在移植入RCS大鼠长时间（>220 d）后，它能吞噬视杆细胞外节，有极性地分泌色素上皮因子[35]，表达ATP依赖的外转运蛋白[36]，在剂量依赖的条件下能维持视功能与感光细胞的完整，而不形成畸胎瘤或者棘手的病理反应[7]。近期临床研究表明hESC-RPE细胞的视网膜下移植安全并且耐受[9]。这份自发分化的方案同样在诱导的iPSC分化为RPE细胞中广泛应用[3-4,37]。hiPSCs分化出的RPE在功能缺陷的RCS老鼠视网膜下移植后，已被证实能促进吞噬感光细胞外节而维持其短期平衡状态[4]。然而，有趣的是，相同条件下撤除bFGF后通过iPS出现产生色素的时间比诱导ES的平均时间明显缩短[37]。尽管这份方案已被多个小组证实是一个从ESCs或者iPSCs分化为RPE的可信方法，但诱导成功时间仍未达成统一。但总而言之，当撤除生长因子后需要1 ～ 8周才能观察到色素化的趋势，而要出现足够大的色素斑点还需要6 ～ 14周。

3.重组蛋白与化合物诱导：Osakada等[38-39]早前建立了利用重组蛋白尤其是信号通路抑制剂使PSC分化为PRE细胞的方法。在这个方案里，hESC克隆在一开始就被分离成3 ～ 10个细胞集落，接着这些集落在含有Dkk-1(Wnt信号通路抑制剂)和Lefty-A(Nodal抑制剂)的培养基中悬浮培养21 d，紧接着种到经纤连蛋白、层黏连蛋白和单纯多聚赖氨酸（PDL）包被的皿中，分化40 d后能在光学显微镜下观察到色素细胞，然而，要观察更多的色素沉着以及多边形态需要超过60 d。分化为成熟的RPE细胞需要4个月。另一些因子如noggin(骨形态生成蛋白拮抗剂)，Shh(sonic hedgehog),胰岛素样生长因子（IGF），激活素等已被报道能诱导RPE的分化[40-41]。然而，这些重组蛋白在动物细胞或者大肠杆菌中生成，这增加了由于种属差异带来的感染和免疫排斥风险。另一方面，Osakada等[42]运用一种改良的方法，即化学抑制剂阻断Wnt与Nodal信号通路，诱导hESCs和hiPSCs分化为RPE细胞。在这一方案中，小分子CKI-7（抑制酪蛋白激酶I阻断Wnt信号通路)和SB431542（抑制激活蛋白受体样激酶-1阻断Nodal信号通路）分别替代了Dkk-1和Lefty-A。这样诱导出的类RPE细胞呈现六边形，表达RPE65和CRALBP,ZO-1阳性，拥有紧密连接并具备吞噬功能。此外，另外一种化合物尼克酰胺也被成功运用到hESCs到RPE细胞的分化中。这种hESC来源的RPE不仅在形态、表达标志物、功能上与真正的RPE相似，而且通过视网膜电图上记录，与13 d后才进行移植的对侧眼相比，其显著挽救了视网膜结构及其功能[43]。相比之下，这种通过小分子诱导hESCs和iPSCs为RPE细胞比重组蛋白有更多优势。因化合物有稳定的活性，在产量上无差别，并且，其不存在生物源性，能确切避免感染与免疫排斥，这对基于人类多能干细胞移植的治疗至关重要。

三、特异性RPE生成

从可遗传的基因突变产生的iPSCs将对再生医学产生重要影响[44]。这种疾病特异性的iPSCs将为研究那些缺乏适合动物模型的疾病致病机制提供空前的机会，同时这增加了疾病调查，药物筛选，以及细胞治疗的机会[45]。2011年，笔者首先建立了从五个视网膜色素变性患者在RP1、RP9、PRPH2或者RHO等拥有突变基因的hiPSCs[46]。其后，这些hiPSCs在体外分化为感光细胞和RPE细胞。有趣的是，这些诱导出的细胞能展现典型内质网应激特征，印证了疾病在体外的表型，这将帮助说明在视网膜色素变性中的基因突变致病机制。2012年，Baharvand小组报道了一种新型、简便、快捷且高效的方法，能直接从有Leber’s先天性黑朦与视神经病变，Usher综合征，视网膜色素变性等的患者hiPSCs分化为RPE细胞[41]。然而上述个体化iPSCS的方法都通过逆转录病毒重编程。为避免逆转录病毒在宿主基因组中的随机重组带来的不可预知的副作用，笔者将非重组性的仙台病毒载体转入四个关键重编程因子（POU5F1、SOX2、KLF4、c-MYC）后，转染入视网膜色素变性患者皮肤细胞中[47]，这将成为RPE移植的可能细胞来源。

四、RPE细胞的移植支架

在健康视网膜中，RPE是由连续的单层极性色素细胞组成的单层结构，通过介于中间的紧密连接在外部视网膜与脉络膜血管中创建了一个屏障[37,48]。RPE移植的最终目的是尽可能恢复规律的极性，运用表面和基底部不同的蛋白，这对正常RPE的功能与维持血-视网膜屏障至关重要。很多研究显示，来源于ESCs[49]和iPSCs的RPE细胞注射入RCS大鼠视网膜下区域后能在一定程度上挽救视功能。然而，很多分离出的细胞经视网膜下或者玻璃体内注射，表现得杂乱无章，不能准确定位，更有细胞从注射部位反流而出。为解决这些问题，很多支架被用来支撑RPE细胞形成拥有细胞连续性与极性的完整细胞层以进行视网膜下移植[50-53]。之前的报道显示相对于视网膜下注射而言，支架的结合能让移植后的细胞生存状态和极性显著提高[54-55]。截止到现在，一系列的聚合物因其生物相容性与降解性能模拟RPE细胞在细胞内基质的情况已被用于构建支架，其中包括天然生物材料和人造聚合物。Lu等[56]为视网膜上皮细胞的培养准备了一层薄的胶原膜支架。RPE细胞种在这些胶原膜上能形成上皮表型并且吞噬感光细胞外节。其后，另一研究组将这些在超薄胶原膜上培养的RPE细胞植入兔子的结膜下与视网膜下[53]。在移植后的16周，仍未有免疫或者排斥反应出现，这也展示了胶原膜在体内的优良生物相容性。人类RPE细胞已被证实能在其他细胞外基质蛋白（纤连蛋白、层粘连蛋白和玻连蛋白），生物高聚物（明胶、基底膜基质），或者组织支架（羊膜）等存活[57]。此外，最近观察发现纤连蛋白-111是hESC/hiPSC-RPE细胞生长的理想基质，即便传数代后仍能维持稳定性[37]。然而，因为不可避免的动物源性的污染，以及机械性能和难控制的降解率，由生物多聚物或者组织构建出连续的支架就显得不那么现实。与生物材料的支架显著不同，合成多聚物能被设计成满足特定移植需求，并且能轻易控制降解率和机械性能[58]。实际上，一系列合成多聚物被广泛研究以求获得在正确定位的条理清晰的RPE细胞层。早在1996年，用低分子左旋聚乳酸（PLLA）和聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）制造出的厚度在（12 ± 3）μm的膜能作为人类胚胎RPE细胞的暂时基质[59]。Lu等[60]证实了在PLGA膜上生长的人类视网膜色素上皮细胞增长率快于组织培养板。如同鹅卵石般的形态与细胞表面的紧密连接这些特征都能在体外实验中看到。紧接着，同一个研究小组用模型基质的表面微模型化去控制RPE细胞形态，使其更先融合与表达分化的基因型[61]。Thomson与其同事发现，PLGA混合PLLA后更有益于人类RPE细胞基质的形成[62]。另外，聚二甲基硅氧烷（PDMS）[63]，聚羟基丁酸戊酸酯（PHBV8）[64-65]，聚亚安酯（polyether urethanes）[66-67]，聚四氟乙烯(ePTFE)[50]等也被经常运用。令人惊讶的是，目前仍有少量报道运用人类RPE细胞/合成支架层进行动物或者人类的视网膜下移植。尽管大量支架能为RPE细胞提供合适的基质，可能会作为有规律的RPE细胞视网膜下移植的临时转运体。不过目前没有PSCs来源的RPE与支架相互之间作用的报道。另外，仍有许多值得思考的问题留待解决：为保证细胞存活以及保持黄斑视力，理想的细胞层需要培养多久？如何能找到组织再生、支架降解与机械性能改变的平衡点？为了能回答这些问题，需要完成更深层次的尤其是体内的实验。

五、结论与展望

PSCs尤其是iPSCs的运用为生物科学以及再生医学开辟了一条全新的道路。时至今日，很多改良后能安全有效地生成特异性iPSCs的非重组法已被建立。然而，下一步就是要建立起一个细胞系选择金标准和有质控的高效产出方法。

如今在干细胞领域的进步为体外从ES或者iPS到生成RPE细胞开辟了新路，可成为与RPE失调相关的视力退化性疾病的有效治疗方法。然而，仍有很多困难需要解决。目前分化的具体流程还不能在保证效率与安全性的情况下精确到每一天，并且在移植前没有精确的标准能够评估功能性质。目前，hESC来源的RPE细胞已经预先移植到了一位进展期Stargardt’s病患者与一位年龄相关性黄斑变性的广泛地图样萎缩患者中进行治疗，然而，在没有进行免疫抑制的情况下移植物能否不因组织相容分子（MHC I 和 II）外源性差异而被免疫系统所接收？尽管从视网膜变性患者的iPSCs能解决免疫排斥问题，为个体化治疗的实现提供了可能，但当它分化为视网膜细胞时却经常出现功能上的缺陷。因此，在临床移植之前精准的基因修正与彻底的评估是必备的。分化而来的RPE细胞会经历不同的阶段（较浅的色素块，棕色色素点，或者较深的色素块），哪种更适合移植仍是个问题？除此之外，多种自然的或者合成的支架仍将继续研发以支撑和运送RPE细胞，不过在组织再生、支架降解与机械性质的平衡问题上却很少被提及。

志 谢衷心感谢研究组每一位成员的不懈努力和实验室中心平台的大力支持

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The research progress toward clinical transplantation of pluripotent stem cell-derived retinal pigmented epithelial cells

Deng Wenli,Xiang Ping,Jin Zibing.Division of Ophthalmic Genetics,Laboratory for Stem Cell & Retinal Regeneration,The Eye Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou 325027,China

Jin zibing,Email：jinzb@mail.eye.ac.cn

Retinal pigmented epithelial (RPE) cell is essential to maintain retinal function.RPE loss or dysfunction is the leading cause of incurable blindness worldwide.RPE cell replacement has been one of the most promising approaches to restore vision for these patients.With rapid progress of stem cell biology,great efforts have been made to induce functional RPE cells from pluripotent stem cells (PSCs),including embryonic stem cells (ESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs).Disease-specific RPE cells differentiated from patient iPS cells are greatly expected to elucidate mechanism of pathogenesis and personalized therapies for retinal degenerative diseases.Additionally,transplantation of induced RPE into subretinal space has shown encouraging remedies in both animal models and clinical trials.In this review,we focus on PSC-derived RPE in field of regenerative medicine and to summarize methods for RPE cell production and delivering .

Pigment epithelium of eye；Embryonic stem cell；Pluripotent stem cells；Retinal degeneration；Stem cell transplantation；

2014-02-10)

（本文编辑：李少婷）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2014.02.004

国家重大科学研究计划(2013CB967502)；国家自然科学基金 (81170879)

325027 温州，温州医科大学附属眼视光医院视网膜再生医疗研究组 省部共建国家重点实验培育基地、卫生部视觉科学重点实验室

金子兵,Email:jinzb@mail.eye.ac.cn

邓雯丽,向萍,金子兵.多能干细胞分化来源视网膜色素上皮细胞移植治疗视网膜变性研究进展[J/CD].中华细胞与干细胞杂志:电子版,2014,4(2):97-103.