三邻甲苯基磷酸酯毒性作用研究进展

(南华大学公共卫生学院,湖南衡阳421001)

三邻甲苯磷酸酯(tri-o-cresyl phosphate,TOCP)是一种有机磷酸酯类化合物,是磷酸三甲苯酯(TCP)中邻位、间位和对位三种同分异构体的一种,TOCP是这三种同分异构体中神经毒性最强的化合物[1]。二十世纪工业发展时期,由于人们对有机磷类化合物的毒性认识不深,有机磷类化合物作为阻燃剂、润滑剂、增塑剂、杀虫剂等而被广泛应用于工业、军事、农业等各个领域,造成有机磷类化合物的严重污染,TOCP中毒事件在欧美各地爆发。上个世纪九十年代,中国因为食品被TOCP污染而发生多起中毒事件。上个世纪因为多起TOCP中毒事件而引起社会的广泛关注,随着人们对毒物认识的不断加深而被禁止使用。二十一世纪,经济快速发展之际,TOCP以另一种方式重新进入人们的视线中,飞机燃油排放物和润滑剂中含有TOCP污染机舱,引起乘客和乘务人员出现神经中毒症状——航空中毒症候群。TOCP进入机体经微粒体酶细胞色素P450作用生成代谢活化产物进一步产生毒性。TOCP最主要的毒性是神经毒性,其中以迟发性神经毒性(OPIDN)为主要特征,但其具体机制并未阐明。TOCP进入机体后主要分布于脑、脊髓和坐骨神经,而其代谢产物主要分布在肝脏、肾脏和肺组织中[2]。在早期,对鸡进行TOCP染毒,Itoh[3]发现脑、脊髓、坐骨神经、肾脏、心、肺、脾脏、消化系统均出现病理学改变,肝脏出现轻微的充血;“JAKE”事件中,部分男性出现性功能损害[4]。由此可见,TOCP具有多种毒性作用,近年来对TOCP各种毒性的研究及相关机制的探索也逐渐受到重视。本文就TOCP的各种毒性研究展开综述。

1 神经系统毒性

人体暴露于TOCP引起毒效应最先观察到的是神经系统症状,而TOCP的神经系统毒性分为急性毒性、慢性毒性、迟发型神经毒性。

1.1 急性毒性

TOCP的急性中毒比较少见,是一次性大剂量暴露TOCP数小时后由于TOCP的抗胆碱能作用而出现的胆碱样中毒症状如：肌肉高度紧张、反射亢进、阵挛、锥体束反射明显受损及永久性上体位运动神经综合征等[4],症状在两天内消失。乙酰胆碱酯酶是一种包含调控结构域和催化结构域的丝氨酸酯酶,TOCP不可逆地共价结合催化结构域中的丝氨酸羟基从而抑制乙酰胆碱酯酶的水解活性;乙酰胆碱是存在突触小体中的一种神经递质,经刺激释放入突触间隙中并刺激突触后膜产生兴奋,而被TOCP磷酸化的乙酰胆碱酯酶无法及时水解乙酰胆碱,乙酰胆碱酯酶抑制率达到70%以上时,乙酰胆碱开始出现聚集,并持续性刺激突触后膜,从而出现胆碱样急性毒性症状[1]。

1.2 慢性毒性

航空中毒症候群属于低剂量暴露TOCP而引起的慢性毒性,同样以抗胆碱能症状为主。TOCP经肝脏微粒体中的细胞色素P450氧化和催化血清白蛋白环化生成代谢产物CBDP,CBDP不可逆地抑制人体的丁酰胆碱酯酶和乙酰胆碱酯酶,丁酰胆碱酯酶同样属于丝氨酸水解酶家族,其机制与乙酰胆碱老化机制相同[5]。

1.3 迟发性神经毒性

迟发性神经毒性(OPIDN)是人和特定种属暴露于TOCP后出现的最主要的神经系统症状。OPIDN是机体摄入毒物后1～3周内出现的一系列神经症状,以远端轴突末端病变为主要特征的不可逆性退行性神经病变,主要症状是周围神经和脊髓束的上行支和下行支的远端部位出现功能丧失和共济失调。主要出现的组织病理学改变有：脊髓和坐骨神经的轴突肿胀、降解,髓磷脂呈片段降解,继发性脱髓鞘渐进性增加,呈Wallerian样变性,轴突远端病变较重,伴随胶质细胞增殖,坐骨神经中滑面内质网、空泡和管状物质增加,有髓神经元轴突中出现神经丝和神经微管的中度聚集等。然TOCP诱发OPIDN的具体机制并不清楚,成为研究TOCP的热点问题,不同的学说和新的机制也在不断的被探索与发现。

神经病靶酯酶(NTE)“老化”机制被公认为是有机磷迟发性神经毒性发生的前提条件。有机磷类物质是NTE的底物类似物,能磷酸化NTE上丝氨酸的羟基,磷酸化的NTE随着时间进程进一步发生老化,即使烷基或芳基迅速被去除形成带负电的亲核物质,致使NTE的活性不可逆[6]。而NTE活性受到抑制只发生在暴露毒物后的72 h之内,之后NTE的活性逐渐恢复,而OPIDN产生症状一般是第1～3周,NTE被抑制到症状出现这一过程中,NTE起什么样的作用?

NTE调控磷脂的代谢,对轴突的维持和神经细胞的生长起关键作用。TOCP损伤轴突的物质获得被认为是轴突变性的重要原因,神经细胞需要依赖内质网和微导管的物质运输维持轴突的功能和生长,NTE具有磷脂酶B和溶血磷脂酶活性,nte基因敲除证明神经元内质网分泌功能受到损伤[7],可见TOCP可能通过抑制NTE活性影响内质网的分泌功能导致轴突的变性。OPIDN轴突变性出现的典型的形态学改变是肿胀,nte基因敲除小鼠的脊髓远端出现轴突的降解,随后肿胀,轴突内出现空泡、肿胀、小泡和细胞骨架蛋白聚集等神经变性样特征[7]。同时也有实验表明,NTE缺陷型神经细胞延迟神经元突起生长,且突起长度比对照组短[8]。犹太人和欧洲人出现的一种遗传性痉挛性截瘫和OPIDN一样是属于肢体运动神经病,是由于NTE催化区发生突变而造成NTE失活[9]。这些都证明NTE对神经元轴突生长和维持起重要作用,NTE如何调节和维持神经细胞轴突的具体过程是TOCP产生OPIDN的一个关键机制。

细胞内钙紊乱和钙相关蛋白酶活性增强这一机制是研究TOCP产生OPIDN的另一重要假说。钙离子是细胞内的第二信使,参与各种信号途径。在早期的动物实验和细胞实验证明TOCP能够引起细胞内钙离子紊乱[10-12],发现L型钙离子通道参与细胞内钙离子紊乱[10]。且有实验证明TOCP作用细胞,引起细胞内一系列钙相关蛋白酶如钙中性蛋白酶(calpain)[13]、钙依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)[14]、ERK1/2[15]、CDK5等[16]酶的活性增加。 钙激活的蛋白酶能磷酸化神经细胞中的神经丝、微管蛋白及相关蛋白等,如：CaMKⅡ磷酸化MAP-2、α/β微管蛋白[17,14],被激活的Erk1和Erk2磷酸化NF-H和NF-M末端的KSP序列[15]。磷酸化的蛋白或聚集或进入蛋白降解系统降解,聚集的磷酸化蛋白从而呈现组织病理学上的微管与微丝的中度聚集,而近年发现calpain蛋白酶增多与骨架蛋白降解密切相关[18,13]。且越来越多的研究证明TOCP诱导自噬溶酶体降解途径增强,自噬抑制轴突的生长与维持[19]。自噬溶酶体途径是细胞中蛋白酶降解系统,细胞内钙离子变化及calpain活性变化诱导自噬,TOCP诱导OPIDN出现轴突退行性变性与自噬密切相关。自噬和凋亡与钙密切相关[20-21]。TOCP诱导自噬成为新兴的机制,但凋亡也频频被报道,线粒体凋亡途径参与TOCP诱导OPIDN病变[22]。

2 生殖毒性

TOCP具有生殖毒性,早期 Somkuti[23-24]对TOCP雄性动物的生殖毒性展开了研究,睾丸与附睾均出现不同程度的不可逆性损伤：精子活率降低,数目下降,睾丸中神经毒性酯酶和非特异性酯酶活性被抑制,组织切片显示生精上皮细胞出现空泡和损伤。近年来动物实验发现随着TOCP剂量的增加,精子生成发生障碍：曲精细管组织结构出现紊乱,生精上皮细胞破坏和萎缩,生精细胞的数目减少等,基因沉默证明NTE受抑制降低生精干细胞的增殖[25]。NTE的活性在神经毒性中研究较多,神经细胞中NTE活性受抑制成为OPIDN的前提条件,同样睾丸中NTE活性受到抑制在TOCP的生殖毒性起关键作用[25]。生精上皮细胞中支持细胞间的紧密连接构成血睾屏障,为精子发生提供特定的环境,生精上皮细胞出现空泡和损伤,可见TOCP损伤血睾屏障,破坏精子发生的特定环境,影响精子生成。

3 肝脏毒性

肝脏是人体的代谢器官,同时也是含各种活性酶最多的器官,绝大部分外源物质都要经过肝脏的代谢排出体外,肝脏对外源化学物的解毒作用至关重要。TOCP经吸收进入肝脏生成代谢产物,经粪和尿液排出体外,TOCP诱发OPIDN动物模型中,Baron[26]研究中肝脏出现轻微的脂肪浸润,Itoh[3]发现肝脏出现轻微充血,且发现肝脏中各种酶出现升高或降低,反映TOCP能够损伤肝脏并引起肝细胞功能异常。

4 免疫毒性及其他

TOCP是脂溶性物质,能经皮肤吸收进入机体产生过敏反应,从事含有TCP增塑剂行业的工人,皮肤出现过敏反应[27]。早期也有研究报道TOCP能对免疫系统造成损伤[28-29]。TOCP及其代谢产物分别于各种组织器官中,Itoh发现肾脏、心、肺、脾脏、消化系统同样出现病理学改变[3],尽管相关方面的研究并未得到报道,但随着OPIDN研究的进行,TOCP的毒性作用必将会被不断的揭露。

5 展 望

TOCP在上个世纪被广泛应用于工业和农业,但由于对其毒性的不断了解而被禁用;二十一世纪,经济飞速发展的时代,航空事业不断壮大,航空中毒症候群再次将TOCP拉上社会的焦点。对TOCP毒性的全面了解既是非常重要的问题同时也是亟待解决的问题。

目前针对TOCP毒物以预防为主,限制TOCP的含量或禁止使用。一旦中毒,没有有效的药物治疗,只能根据临床症状采取相应的临床措施。随着TOCP对OPIDN机制研究的不断深入,L-型钙通道阻断剂如：维拉帕米和尼莫地平能减缓TOCP引起的临床症状,NTE活性抑制剂PMSF同样可作为潜在的药物治疗TOCP中毒。TOCP毒性作用主要体现在神经系统、肝脏、睾丸和免疫系统,各系统与器官损伤程度不一,最先出现的临床症状在神经系统,同时也以神经系统症状最明显最严重。目前以神经系统和睾丸为主要研究靶器官,TOCP诱发OPIDN不同机制的提出促进TOCP毒性作用的深入研究,为其他毒物的迟发型神经毒性或神经退行性病变等提供参考依据,不同器官系统毒性的研究有利于更进一步了解TOCP毒性,为TOCP毒性新机制的发现提供更有力证据,同时TOCP毒性具体机制的进一步阐明,促进相应药物的开发。对TOCP多毒性作用的全面了解,有利于临床治疗过程中对中毒者病情的全面把握及为患者的治疗提供参考价值,同时对其他有机磷毒物研究有重要借鉴意义。

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