结核性脑膜炎结核分枝杆菌检测方法的研究进展

文安 张昆南

结核性脑膜炎(tubercular meningitis，TBM)是由结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis，MTB)引起的中枢神经系统非化脓性炎性疾病，其临床表现不典型。传统的TBM诊断金标准为脑脊液抗酸染色阳性、MTB培养阳性。2009年南非开普敦会议通过的TMB诊断标准[1]认为，除上述两项标准外，采用PCR方法检测到MTB的DNA也为TBM确诊的“金标准”之一。

1 脑脊液涂片抗酸染色

齐尔-尼尔森(Ziehl-Neelsen)抗酸染色法检测抗酸杆菌(acid-fast bacillus，AFB)要求脑脊液中MTB的细菌数量达5000～50000个/mL，由于绝大多数患者脑脊液中MTB数量不足，阳性率仅为10%～20%[2]。为此，Thwaites等[3]改进了此方法，其对132例临床诊断TBM患者腰穿抽取6 mL以上脑脊液，以3000g离心15 min沉淀细菌，镜检AFB观察时间大于30 min，其AFB阳性检出率达到58%。然而，现有研究认为腰穿抽取脑脊液6 mL对一些患儿会存在危险[4]，且镜检时间大于30 min对于忙碌的检验人员难以接受。此外，Kennedy等[5]采用多次腰穿取脑脊液涂片行抗酸染色检测，结果发现52例TBM患者接受1次腰穿脑脊液检查AFB检出率为37%，接受4次检查者AFB检出率可提高到83%。尽管如此，多次行腰穿增加了医生的负担及腰穿并发症的潜在风险，患者也难以接受。

近年来，Das等[6]采用金胺酚染色荧光显微镜观察，能够较Ziehl-Neelsen法AFB检出率提高5%～10%。Fennelly等[7]将含有20 000～40 000个/mL MTB的溶液通过一张直径13 mm、孔径0.4 μm的聚碳酸酯滤膜过滤浓缩细菌(SMFs)后，采用金胺酚染色后用荧光显微镜观察，其AFB检出率提高到89%。我国学者采用TritonX-100处理脑脊液后，利用细胞离心涂片机将细菌浓缩后置玻片上行Ziehl-Neelsen染色，其AFB检出率为100%，且多为胞内分枝杆菌，远高于传统的抗酸染色法[8]。这些改进的MTB检测方法较传统染色法检出率显著提高，但目前研究样本量较少，仍需增大样本进行证实。

2 MTB培养

脑脊液中培养出MTB是确诊TBM的最权威方法，现对目前主要的MTB培养方法进行介绍。

2.1固体培养法传统的固体培养基包括罗氏、Ogawa培养基等，药敏试验种类多，便于指导临床抗结核药物的选择，在发展中国家广泛使用。但此类方法耗时长，即使在条件适宜时采用改良罗氏(L-J)培养法培养MTB平均耗时亦达3周，药物敏感性试验另需3～4周，同时L-J培养法缺乏敏感性和特异性，使得这种培养方法无法为临床及时诊断提供有效帮助[9]。

2.2液体培养法液体培养基中MTB生长速度快，药敏试验时间短，现已逐渐取代传统的L-J培养法。目前普遍采用的有BACTEC、MGIT960快速培养系统和显微镜观察药物敏感性检测技术(MODS)。

2.2.1BACTEC快速培养系统：Baveja等[10]采用此方法对100例TBM患儿脑脊液进行L-J培养法、BACTEC培养、PCR检测，结果显示BACTEC培养及PCR检测均为MTB阳性的22例经改良L-J培养法培养阳性者仅6例(阳性率27.3%)。Venkataswamy等[11]分别用BACTEC 460TB快速培养系统与传统L-J培养法培养脑脊液，结果显示BACTEC培养系统MTB阳性率为61%，L-J培养法阳性率仅为7%。这些研究结果提示BACTEC培养法较传统L-J培养法明显提高了MTB阳性检出率。

2.2.2MGIT960快速培养系统：张娟等[12]对比研究了MGIT960系统与L-J培养法检测MTB的效果，MGIT960系统培养出现阳性结果的时间(报阳时间)平均为9.5 d，显著短于L-J培养法的31.5 d，该作者提出MGIT960系统可能是目前最为理想的快速MTB培养系统。吴学兵等[13]也采用MGIT系统对1598例肺结核患者的痰液进行培养，新发患者痰液培养阳性率为32%，平均报阳时间为13.63 d；复诊患者阳性率为9.3%，报阳时间为22.94 d，此研究结果表明抗结核治疗后MTB减少，检出率下降。

2.2.3MODS技术：Caviedes等[9]建立的MODS技术是一种基于液态培养方法的显微镜观察药物敏感性检测技术，该技术能够同时进行MTB培养及其药物敏感性检测，其所需时间不超过2周。Caws等[14]在Caviedes的基础上将MODS技术应用于TBM的诊断，他们对156例临床拟诊TBM患者的脑脊液分别进行Ziehl-Neelsen抗酸染色、MODS、分枝杆菌生长指示管(MGIT法)、L-J培养法等检查，结果发现培养阳性率MODS技术为64.9%，MGIT法是70.2%，L-J培养法是70.2%，Ziehl-Neelsen抗酸染色阳性率是52.6%；但是MODS法中位报阳时间则显著缩短至6 d，MGIT 法为15.5 d，L-J培养法为24 d。黄自坤等[15]对63例TBM的脑脊液分别进行MODS和改良L-J培养法培养，结果MODS的阳性率为54%，远高于改良L-J培养法的20.6%。Ha等[16]收集32例TBM患儿脑脊液进行MODS和MGIT培养检测，结果显示MTB检测敏感性和特异性分别为42.3%、100%和39.7%、94.4%，平均报阳时间为8 d和13 d，表明MODS培养报阳时间也明显短于MGIT培养。我国学者采用MODS法检测胸腔积液和脑脊液中MTB，其检出敏感性为20.5%和37.5%，特异性均为100%，平均报阳时间为14 d和9 d，而采用传统L-J培养报阳时间为32 d和31 d[17]。

2.3其他培养法Bhattacharya等[18]研究出一种双层介质培养基，分别与罗氏培养基、Middle brook 7HI0(7HI0)及Kirchner’ s培养基进行对比培养，培养7 d时双层介质培养法MTB阳性率为81.7%，最早报阳时间为48 h，其阳性率显著提高并缩短报阳时间。还有学者用孔径为0.45 μm的滤膜对脑脊液进行过滤，再用滤膜进行培养，明显提高了MTB检出阳性率[19]。与传统的固体培养基培养相比，液态培养技术明显提高了MTB培养阳性率，缩短了报阳时间，具有快速、操作简单、价廉等优势，值得在广大的基层医院推广和应用。

3 MTB聚合酶链反应技术(PCR)

Mete分析显示PCR技术诊断TBM敏感性可达到56%，特异性可达到98%[20]。目前其他类型的PCR技术也逐步应用于MTB的检测。

3.1多重PCR技术多重PCR(multiplex PCR)技术能够在一个反应体系中同时对多个目的DNA片段进行扩增，具有低成本、高效率等特点。Kusum等[21]利用多重PCR技术对210例脑脊液标本(其中18例为确诊TBM)同时扩增protein b、MPB 64，确诊TBM组的敏感性达94.4%，特异性为100%。利用多重PCR技术检测多个目的基因较早期使用的PCR技术明显提高了对MTB的诊断敏感性[22-23]。

3.2巢式PCR技术巢式PCR技术(Nest-PCR)使用两对PCR引物对目的基因片段进行扩增，较常规PCR显著增加了循环次数，使得目的基因更易被检测，提高了检测的敏感性。Huang等[24]利用巢式PCR技术对MTB rpoB、MPB-64、IS6110基因进行扩增，检测MTB的敏感性达86%，特异性达100%。Nandagopal等[25]扩增MTB IS6110特异性基因片段，结果敏感性达100%，特异性为95.1%。与常规PCR技术相比，巢式PCR技术简化了操作步骤，降低了交叉污染的机会，减少了假阳性。

3.3环介导等温扩增技术(LAMP) LAMP是一种在恒温的条件下即可实现对目的DNA进行特异、高效扩增的技术。与常规PCR和荧光定量PCR技术不同的是，LAMP不需特殊的实验设备和专业的技术人员，操作简单，具有快速、高灵敏、价廉等优势，尤其适合经济条件一般和一些非专业的实验室使用 。采用LAMP技术检测痰涂片MTB阳性的痰液标本可以获得98%的敏感性和94%的特异性[26]。刘云等[27]采用LAMP技术检测结核性胸腔积液，MTB阳性率为61.7%。有研究者应用LAMP和巢式PCR技术同时对MTB ISS6110基因进行扩增，结果巢式PCR技术诊断敏感性为52.9%，特异性为90%，而LAMP敏感性和特异性分别为88.23%、80%，所需条件为63°C，反应时间1 h。上述研究表明与其他PCR技术相比， LAMP技术明显缩短了反应时间，提高了TBM诊断的敏感性[28]。Yang等[29]的研究表明LAMP技术检测MTB的敏感性高于实时荧光定量PCR技术，特别适用于涂片和培养阴性的样本。

3.4利福平耐药实时荧光定量核酸扩增技术(XpertMTB/RIF) Xpert MTB/RIF技术是一种基于巢式PCR技术发展而来的基因扩增技术，在2 h内能够同时检测MTB及其对利福平的耐药性，2010年世界卫生组织(WHO)将其推荐用于结核病的诊断。近来Xpert MTB/RIF已经广泛应用于肺结核的诊断，其诊断肺结核(痰涂片阴性，培养阳性)标本的敏感性为76.9%，特异性为99%，检测利福平耐药的敏感性为94.4%，特异性为98.3%[30]。Hillemann等[31]应用Xpert MTB/RIF技术对521份人体体液标本(脑脊液19份)进行检测，结果脑脊液检测结果显示TBM诊断敏感性为77.3%，特异性为100%。另外有研究报道Xpert MTB/RIF检测脑脊液标本MTB的敏感性27%～86%，特异性99%～100%[32]。Alvarez-Uria等[33]对比Xpert MTB/RIF技术和荧光显微镜镜检对MTB的诊断价值，结果显示Xpert MTB/RIF对MTB的检出率是荧光显微镜检的12倍。然而，Xpert MTB/RIF价格昂贵，短期内难于广泛推广和应用。虽然PCR技术对TBM检出率最高、耗时也较短、所需脑脊液量少，但其容易受外界干扰，检测结果存在一定的假阳性和假阴性，仅凭1次结果有时难于作出准确诊断，需结合临床资料综合判断。

此外，增加患者腰穿次数、增加脑脊液所测容量、浓缩脑脊液等以提高MTB含量，在此基础上采用简单、易行、方便推广的ELISA方法能够提高MTB的检测敏感性和控制非特异性。然而，目前相关的研究较少，难于将其推广用于临床MTB的检查。本文作者的研究组采用基于脑脊液浓缩技术的dot-ELISA法[34]和双抗夹心ELISA法[35]检测MTB，其敏感性分别为93.1%和78.26%，特异性分别为92.5%和96.42%。

虽然近年来脑脊液MTB的检出技术已经取得了进步，然而由于MTB在脑脊液中含量低，致使目前的检测敏感性仍不高，总体上并未显著提高MTB的诊断率。相信随着研究的不断深入，将会有更为简单、方便、易于推广的新方法用于早期MTB的诊断。

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