葎草组分测定、有效成分提取及不同提取物抗菌性的研究

2014-01-22蔡凤英刘来亭胡新旭马秋刚

饲料工业 2014年5期

■张勇黄进蔡凤英刘来亭胡新旭计成马秋刚

（1.河南工业大学生物工程学院，河南郑州450001；2.湖南省微生物研究所，湖南长沙410009；3.中国农业大学动物科技学院，北京100193）

葎草（Humulus scandens(Lour)Merr）为桑科大麻亚科葎草属一年或多年生草本植物。药学上具有清热解毒、利尿通淋的功效。别名有拉拉秧、锯子草、五爪龙等，葎草资源丰富，抗逆性强。葎草全草的化学成分复杂，含有木犀草素、葡萄糖甙、胆碱、天门冬酰胺，挥发油、鞣质及树脂等多种物质。本文对葎草地上部分常规成分进行了分析，利用GC-MS技术对葎草挥发性成分进行测定，以提取的溶质量和生物碱以及类黄酮木犀草素为指标，比较不同提取方法对葎草中有效成分提取的程度。进一步对不同提取液提取出的活性成分进行了抑菌试验，为筛选较好的提取剂提供依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

葎草采自河南工业大学，分别采自5、7、9月份（分别代表苗期、生长期和盛果期）。样品风干后，粉碎过60目，备用。

1.2 试验方法

1.2.1 葎草常规成分分析

水分、粗蛋白质、粗脂肪、粗灰分分别按照GB6479-86、GB6432-86、GB6433-86、GB6438-86的方法进行测定，氨基酸采用waters2695高效液相色谱仪测定。

1.2.2 挥发油成分的提取和测定

采用GC-MS(Finnigan Trace2000 GC-MS)测定挥发油成分。

定性分析：利用的数据库为美国国家标准及技术研究所DATABA5E/NIST.98L；DATABASE/WILEY275。经过系统质谱库自动检索被分析组分的质谱，分别参照标准图谱及质谱的裂解规律、八峰索引、基峰质荷比和相对丰度、EPA/NH以及有关文献对照，以确定各个组分。

定量分析：扣除溶剂峰之后，化合物的定量使用Hewlett-Packard软件，选择设定适当参数，按峰面积归一化计算各较大峰的峰面积相对百分含量。

1.3 抗菌试验

1.3.1 葎草提取液的制备和活性成分检测

取葎草样品10 g，用滤纸包好，置于回流提取器内，以95%乙醇为提取剂，以流水冷凝，在90℃水浴锅内回流提取3 h，将得到的提取液用旋转蒸发浓缩至膏状，放入真空干燥箱中烘干，所得固形物准确称量。后加入10 ml蒸馏水，超声波分散溶解，得到95%乙醇提取液。同样的方法分别以三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、蒸馏水作为提取剂，则分别得到三氯甲烷提取液、乙酸乙酯提取液、丙酮提取液、蒸馏水提取液。将五种葎草提取液灭菌后，分别用灭菌的生理盐水将制成的各提取液稀释成0.25～1 000 μl/ml 13个倍比稀释系列浓度。

提取液中生物碱的定性检测按照谢仲权（2004）碘化铋钾试剂法，定量测定按照雷氏盐沉淀溶解比色法进行；提取液中黄酮类测定参照郭亚健（2006）比色法，即以硝酸铝显色,以芦丁为标样，测定A510制作标准曲线。

1.3.2 菌悬液的制备

参照熊皓平（2002）方法，在无菌工作台中，将接种环在火焰上灼烧几次，挑取少许菌苔于装有9 ml灭菌生理盐水的试管中，混匀，制成菌悬浮液。再吸1 ml菌悬浮液加入到有9 ml蒸馏水的试管中，以此类推得到菌悬浮液的浓度至菌体为109个/ml，4℃冰箱存放备用。

1.3.3 抑菌效力测定——滤纸片法

用打孔器将滤纸打成直径11 mm的滤纸片，高压灭菌后，分别浸泡于各提取液中。另取一些滤纸片浸泡于相应提取溶剂内，作为对照。将固体培养基高温灭菌后倒入平皿，待冷却凝固后，分别加入0.2 ml供试菌液，用无菌棒涂布均匀。用无菌镊子夹取浸透各提取液的滤纸片，贴在含菌培养基的表面,每皿5片，另外用浸在氟哌酸的滤纸片作对照，用每种提取液设置一个校正对照，设3个重复。倒置于37℃恒温培养箱内培养24 h，用游标卡尺测量抑菌圈直径，比较各提取原液的抑菌效力。

1.3.4 MIC测定——平板稀释法

参照《全国临床检验操作规程》关于MIC的检测方法，于直径9 cm的灭菌培养皿中分别加入0.3 ml不同浓度的提取液，然后注入已经融化的冷却至45℃的琼脂培养液，立即旋转混匀。待冷却凝固后，每皿加入0.1 ml菌悬液涂匀培养，同时采用蒸馏水作为对照。置于5%CO2培养箱，37℃孵育24 h后置低倍镜下观察每一株菌在含不同药物各种浓度琼脂平板上阳性菌菌落数，取5个视野，以未见菌落生长的提取液浓度为MIC。

1.4 供试菌种

指示菌种为肠型点状产气单胞菌(Aeromonas punctata fintertinalis,58-20-79)，苏伯利产气单胞菌（Aeromonas sobria，CR79-1-1），荧光假单胞菌（Pseu⁃domonas fluoorescens,56-12-10），购自中国科学院水生生物研究所鱼病室，三种菌是草鱼“三病”的主要致病菌。普通培养基配方见表1。

表1 培养基配方

2 结果与分析

2.1 葎草常规成分的含量

葎草中粗蛋白、粗脂肪等常规成分见表2。氨基酸含量见表3。

2.2 挥发油组成成分

对葎草挥发性成分用GC/MS进行分离得到了色谱离子流图和质谱数据。总离子流见图1。对图中经EI图谱分析及标准图谱检索定性，各组分相对质量含量用峰面积归一化法得到,结果见表4。从所鉴定的100多种成分中，鉴定出的成分占整个挥发性成分质量分数的78.44%。其中含量在3%以上的组分有：α-石竹烯 (16.120%)、葎草烯 (14.853%)、丙二醇(7.420%)、葎草酮 (3.561%)、2，5- 降冰片二烯(3.077%)。它们可作为该药材的指纹性组分。

表2 葎草中常规成分和挥发油含量(%)

表3 葎草的主要氨基酸种类和含量以及化学评分(%)

2.3 不同提取剂提取液固形物

2.3.1 提取固形物的量

经不同时间对提取液烘干称量，得到最佳提取时间（不同的提取剂最佳的回流时间不同）时，不同的提取剂得到葎草提取液固形物量以95%乙醇提取液最高为8.4 mg，丙酮提取液为3.7 mg，蒸馏水提取液为2.2 mg，三氯甲烷提取液为1.1 mg，而乙酸乙酯得到的提取液中固形物最少，浓度仅为0.6 mg。从固形物含量来说，以乙醇提取剂效果较好。

2.3.2 提取物中总生物碱、总黄酮的含量（见表5）

从表5看出，乙酸乙酯提取物中生物碱的含量很低。而以乙醇和蒸馏水提取物中含量高。不同提取液提取的总黄酮量是不同的，以乙酸乙酯提取量较高。

2.4 抑菌效力测定结果（见表6）

从表6可见，葎草的5种提取液，抑菌效果虽然没有氟哌酸药液好，但对引起草鱼的三大常见疾病的病原菌均有抑制作用。各提取液之间抑菌效果差别不显著。

2.5 最小抑菌浓度（MIC）测定结果（见表7）

图1 葎草挥发油总离子流

由表7可见，葎草95%乙醇提取液、乙酸乙酯提取液、丙酮提取液、三氯甲烷提取液、蒸馏水提取液对所试菌种均有不同程度的抑制作用，综合效果来看，乙醇提取物抑菌效果最好。对苏伯利产气单胞菌抑制效果次序是丙酮、95%乙醇、乙酸乙酯、蒸馏水和三氯甲烷等葎草提取液。对肠型点状产气单胞菌抑制效果次序是95%乙醇、乙酸乙酯、丙酮、三氯甲烷和蒸馏水提取液。对荧光假单胞菌抑制效果较好的是95%乙醇提取液，其他溶剂提取液效果相近。

3 讨论

3.1 葎草常规组成成分结果

葎草成分干物质中含粗蛋白较高，但粗纤维较高，又缺乏必需氨基酸，基础饲料中含量高会影响饲料的消化、利用，也限制了直接作为添加剂加入到饲料中。李守阳（2003）对葎草进行的分析显示，粗蛋白在12.8%～19%之间。与本试验结论一致，说明不同产地的葎草在粗蛋白含量变化差异很小。

3.2 不同提取剂提取固形物

中草药采用不同的提取方法得到成分差别很大（曲原君，2002）。本研究采用四种不同的提取方法，按照提取的有效成分抑菌活性和提取物中固形物的含量来进行比较以选出相对经济、有效的提取方法以进行后续试验。检索近十年有关植物提取物的文献中，其中使用乙醇和水作溶剂的比较多。关于采用乙醇的浓度，在本研究预试验时，已经对乙醇的提取浓度和提取时间进行了筛选，选用95%浓度乙醇来提取效果最好。提取物中生物碱的含量达3%以上，总的黄酮类也达2%以上。虽然提取的总生物碱和总黄酮的含量有点低，可能与没有对提取物纯化有关。在不明白何种组分起作用的情况下，只提取不纯化可以尽量维持原药物成分不变。

表4 葎草全草中挥发成分

表5 不同提取物中总生物碱和总黄酮的含量

表6 不同提取物的抑菌作用（抑菌圈直径,mm）

表7 葎草提取液对三种菌的最小抑菌浓度(μl/ml)

3.3 葎草提取物中总生物碱、总黄酮的含量

生物碱在植物体内多以盐的形式存在，而弱碱性或中性的生物碱则以不稳定的碱或游离的形式存在。生物碱盐类一般不溶于亲脂性有机溶剂而溶于水或醇（谢仲权，2004）。因此本研究用乙醇和水为提取剂所得生物碱含量高。

黄酮类在自然界中分布广泛，属植物次级代谢产物，因多呈黄色而称生物类黄酮，大多数绿色植物中都含有黄酮类化合物，对于葎草中黄酮的含量报道很少。目前总黄酮的提取方法主要有水提取、碱提酸沉、乙醇提取、微波辅助提取、超临界萃取等方法（Zhang等,2003）。本研究中提取率最高的是用乙酸乙酯作提取剂，但从固形物和活性成分的总量方面考虑，选乙醇作溶剂提取效果比较好。

3.4 抑菌效力测定结果

高汉桥等（1996）认为在生产中因地制宜地选择具有抑菌作用的中草药防治由嗜水气单胞菌引起的鱼病，可能具有实际意义。很多中草药的乙醇提取物体外抑菌试验被证明对嗜水气单胞菌、温和气单胞菌有抑制作用（宋学宏，2001；李军红等，2006）。周群兰等（2007）用大黄提取物观察对嗜水气单胞菌的抑制效果，发现大黄提取物对水产养殖过程中不同病原菌有不同的抑制作用。气单胞菌(Aeromonas hyd rophi⁃la)隶为人、畜及水生动物共患的条件致病菌，广泛存在于水环境中，是多种水产动物的主要致病菌。通过纸片药敏试验发现，葎草醇提取物对气单胞菌的抑菌圈直径达9 mm左右，虽然没有周群兰（2007）用大黄提取物抑菌圈直径可达29 mm效果好，但与叶元土等（1994）发现大黄煎剂对鲤烂鳃病原菌的抑菌圈直径可达10 mm以上效果相当。