响应面法优化固态发酵生产花生粕饲料的研究

■李明华 孟秀梅 徐生林 张贵英 张晓春

(1.江苏食品药品职业技术学院，江苏淮安 223003；2.徐州万佳牧业科技发展有限公司，江苏徐州 221148）

花生粕是花生仁经压榨提油后的副产物，富含蛋白质，适合在禽畜水产饲料中使用。花生粕的营养价值较高，粗蛋白含量在38%～47%之间，且含有动物必需的8种氨基酸，属于完全蛋白[1]。花生蛋白具有良好的功能性质和营养特性，其功能性与大豆蛋白接近，却比大豆蛋白更易吸收，含有的抗营养因子比大豆更少，是一种优良的饲料加工蛋白质原料[2]。但是，国内企业主要通过热榨和有机溶剂浸提法提取花生油，提油后得到的花生粕，蛋白质变性严重，营养价值较低。因此，为了充分发挥花生粕的饲用价值，只有进一步处理以提高其在动物体内的消化吸收率，才能更好的应用这一蛋白质资源。

现代营养学研究发现，蛋白质经动物消化道中的酶降解后，大多是以寡肽的形式被消化吸收的，以游离氨基酸形式吸收的比例很小，而且寡肽在机体内的吸收、代谢速度也比游离氨基酸快[3]。此外，寡肽除具有调节动物肠道菌群、促进有益微生物生长繁殖的功效外，还具有促进动物生长，提高动物机体免疫力的作用[4]，这对于降低饲料中抗生素的使用量，降低畜牧产品药物残留具有重要的意义。

因此，通过微生物发酵降解花生粕中的花生蛋白，制备花生肽含量丰富的花生粕饲料，具有广阔的应用前景。本研究将应用响应面法优化花生粕混菌固态发酵的工艺，旨在提高花生粕中花生肽的含量，以提高其在机体内的消化吸收率，同时发挥一定的功能特性。

1 材料与方法

1.1 试验材料

热榨花生粕(山东鲁花集团有限公司提供)麸皮(购于济南市农贸市场)。

1.2 试验菌株

枯草芽孢杆菌1.0769(购自中国科学院微生物研究所)、米曲霉3.4383购自中国科学院微生物研究所。

1.3 培养基

1.3.1 枯草芽孢杆菌培养基

牛肉膏5 g，酵母膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，pH值7.0，H2O 1 000 ml，121 ℃灭菌20 min，固体培养基加2%的琼脂粉。

1.3.2 霉菌培养基

取去皮马铃薯200 g，切成小块，加水1 000 ml煮沸30 min，4层纱布过滤，将滤液补足至1 000 ml，加葡萄糖20 g，121℃灭菌20 min，固体培养基加2%的琼脂粉。

1.3.3 固体发酵培养基

将花生粕烘干后粉碎至40目，加入10%的麸皮和一定量的纯净水，分装入250 ml三角瓶，装量为每瓶50 g，用6层纱布封口，121℃灭菌20 min。

1.4 液体种子的制备

1.4.1 枯草芽孢杆菌种子制备

将活化好的枯草芽孢杆菌菌种从斜面培养基中转接至装有50 ml细菌培养基的250 ml三角瓶中，在恒温摇床中30℃、150 r/min振荡培养20 h。

1.4.2 米曲霉种子制备

在长满米曲霉孢子的试管斜面中加入5 ml无菌水，用无菌刮铲将孢子轻轻刮下，按2%的比例接入装有50 ml霉菌培养基的250 ml三角瓶中，在恒温摇床中28℃、150 r/min振荡培养72 h。

1.5 花生粕固态发酵工艺优化方法

1.5.1 固态发酵方法

将制备的枯草芽孢杆菌和米曲霉种子以总量为10%的比例接入固体发酵培养基中，混合均匀，置于恒温培养箱中静置培养。发酵结束后，将培养基置于烘箱中90℃烘干，粉碎至100目后测定花生蛋白的水解度。

1.5.2 单因素试验

以花生粕中花生蛋白的水解度为指标，研究不同菌种比例、培养基含水量、发酵温度和发酵时间对花生粕中花生蛋白水解度的影响。

1.5.3 响应面的组合试验

在单因素试验结果的基础上，根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理，选取菌种比例、培养基含水量、发酵温度和发酵时间四个因素，采用4因素6水平的响应面分析方法进行实验设计，优化花生粕的发酵工艺。

1.6 花生蛋白水解度的测定方法[5-6]

发酵结束后，将发酵后的花生粕置于烘箱中90℃烘干，粉碎至100目后，测定样品中游离氨基氮含量，计算花生蛋白的水解度。

式中：Ah——不同时间发酵液中的总游离一NH2数(mmol)；

A0——原料蛋白中固有的游离一NH2数(mmol)；

A总——原料蛋白强酸水解后的总游离一NH2数(mmol)。

“是的，我看到很多人为减肥做出的最大努力就是，吃火锅、吃烤肉、吃蛋糕、吃冰淇淋的时候，配一瓶无糖饮料。”

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 菌种比例对花生蛋白水解度的影响(见图1)

图1 菌种比例对花生蛋白水解度的影响

试验采用枯草芽孢杆菌和米曲霉的不同混合比例为发酵条件进行发酵，分别采用枯草芽孢杆菌∶黑曲霉为1∶3、1∶2、1∶1、2∶1和3∶1五个不同的接菌比例进行发酵，其中培养基含水量为50%，发酵条件为30℃、发酵时间为96 h。由图1可以看出，随着枯草芽孢杆菌接种比例的提高，花生蛋白的水解度逐渐增高，当菌种比为1∶1时达到最高，为34.3%；此后，随着枯草芽孢杆菌比例的进一步增大，水解度逐渐降低。这是因为米曲霉比枯草芽孢杆菌生长繁殖速度慢，降低米曲霉的接种比例后，其蛋白酶的分泌量也相应降低，最终影响了花生蛋白的降解。因此，枯草芽孢杆菌∶黑曲霉为1∶1时为混合菌种发酵的最佳菌种比例。

2.1.2 培养基水分含量对花生蛋白水解度的影响(见图2)

图2 水含量对花生蛋白水解度的影响

以两菌种比例为1∶1的混合菌种接入含水量不同的固体培养基中，30℃发酵96 h后，比较花生蛋白的水解度。由图2可得，随着培养基含水量的逐渐增加，花生蛋白的水解度也逐渐升高，当含水量达到50%时，花生蛋白的水解度基本保持稳定，继续提高培养基的含水量，水解度变化不大。这是因为酶解反应均需在溶液中进行，当培养基的含水量较低时，蛋白酶和蛋白质无法充分接触，从而影响了花生蛋白的水解。

2.1.3 发酵温度对花生蛋白降解的影响(见图3)

图3 发酵温度对花生蛋白水解度的影响

以两菌种比例为1∶1的混合菌种接入含水量为50%的固体发酵培养基中，分别在不同温度条件下发酵96 h后，测定花生蛋白的水解度。由图3可以看出，发酵温度低于32℃时，花生蛋白的水解度随温度的升高而不断升高，当温度升至32℃时，花生蛋白的水解度达到最大值，随后随着温度的进一步升高水解度则呈降低趋势。由此可见，在32℃时，固体培养基中蛋白酶的总活力达到最高，花生蛋白的水解程度达到最大，为33.1%。

图4 发酵时间对花生蛋白水解度的影响

以两菌种比例为1∶1的混合菌种接入含水量为50%的固体发酵培养基中，在32℃培养箱中发酵不同时间后测定花生蛋白的水解度。在发酵的起始阶段，两菌株迅速生长繁殖，蛋白酶随之分泌至培养基中，花生蛋白的水解度由此逐渐提高，在发酵72 h后，菌种产酶的能力大大降低，因此花生蛋白的水解度趋于平缓，基本保持不变，从工业化生产的角度来看，发酵72 h比较合理。

2.2 响应面设计结果与分析

2.2.1 数学模型的建立与显著性分析

在单因素试验基础上，确定出响应面试验方案的因素水平表（见表1）。按照响应面试验方案进行试验，试验结果见表2。

表1 Box-Behnken响应面设计试验因素水平和编码

对表2数据采用Design Expert 7.0软件进行多元回归拟合，获得花生蛋白水解度对菌种比例、培养基含水量、发酵温度和发酵时间的二次多元回归方程：Y（水解度）=37.95+0.52×A-1.35×B+2.52×C+1.50×D+2.48×A×B-0.12×A×C+0.078×A×D+3.67×B×C+0.85×B×D-1.77×C×D-1.63×A2-3.26×B2-3.42×C2-0.87×D2。

从表 3回归模型分析结果可以看出，模型 P=0.000 2＜0.01，表明该回归模型达到了极显著水平，说明该模型是有意义的。模型失拟项P=0.0744＞0.05，表明失拟项不显著，模型预测值与实际值拟合较好。该模型的，变异系数为 5.25，说明模型拟合程度比较好，试验误差小，可用该模型分析和预测不同发酵条件下花生蛋白的水解度。由回归分析结果还可得知，在所选的各因素水平范围内，对花生水解度的影响大小排序顺序为：发酵温度＞发酵时间＞培养基含水量＞菌种比例；方程中C、BC、B2、C2对花生蛋白水解度的影响极显著，B、D、AB、A2对花生蛋白水解度的影响显著，这表明各个影响因素与响应值不是简单的线性关系，二次项和交互项对花生蛋白的水解度也有影响。

表2 Box-Behnken设计方案及响应值结果

表3 二次回归模型方差分析结果

2.2.2 发酵条件的响应面分析与优化

在响应面图中，可根据等高线的形状判断各因素交互作用的强弱，等高线为椭圆形时两因素交互作用显著、各等高线排列越密集，表明因素的变化对结果影响越大；等高线为圆形时，两因素的交互作用较小[7-8]。根据本试验回归分析结果，做出相应的等高线和相应曲面图，如图5～图10所示。其中，图5和图8响应面图的等高线比较密集，说明菌种比例与培养基含水量(AB)、培养基含水量与发酵温度(BC)的交互作用对花生蛋白的水解度具有显著的影响；此外，图5～图10中的各个响应曲面均为凸面，表示该模型在试验范围内存在稳定点，且稳定点为最大值。

2.2.3 验证试验

图5 菌种比例和培养基含水量对花生蛋白水解度的影响

图6 菌种比例和发酵温度对花生蛋白水解度的影响

图7 菌种比例和发酵时间对花生蛋白水解度的影响

图8 培养基含水量和发酵温度对花生蛋白水解度的影响

由软件自动分析可得，当枯草芽孢杆菌与米曲霉接种比例为1.45，培养基的含水量为51.25%，发酵温度为33.03℃，发酵时间为88.11 h时，花生粕中花生蛋白的水解度最大，达到38.76%。为方便实际操作，选取接种比例为1.5，培养基含水量为50%，发酵温度为33℃，发酵时间为88 h，在此条件下验证模型预测的准确性。验证结果表明，3个平行试验的平均值为38.32%，与理论预测值相符，证明本研究方法对混菌固态发酵生产花生肽饲料的条件优化是可行和准确的。

图9 培养基含水量和发酵时间对花生蛋白水解度的影响

图10 发酵温度和发酵时间对花生蛋白水解度的影响

3 结论

在单因素试验的基础上，利用响应面法对混菌固态发酵生产花生粕多肽饲料的条件进行了优化，建立了菌种接种比例、花生粕含水量、发酵温度和发酵时间四个因素的二次多项式回归模型，经验证试验证明该模型是合理可靠的。由该模型得到的优化发酵工艺参数为：枯草芽孢杆菌与米曲霉菌种比例为3∶2，花生粕含水量为50%，发酵温度为33℃，发酵时间为88 h，在此条件下，花生粕中花生蛋白的水解度为38.32%，与理论值基本相符。因此，利用响应面分析方法对花生粕固态发酵制备花生粕多肽饲料的条件进行优化，可获得最优的工艺参数，这为进一步的试验研究鉴定基础。