心肌肥厚大鼠心肌Cx43的表达及法舒地尔的干预作用*

李 乐，尚 好，程杰坤，陶厚权，张彩玲

（1.浙江工业大学药学院，杭州310032；2.浙江省人民医院中心实验室，杭州310014；3.杭州之江学院，浙江 杭州310023）

细胞缝隙连接是心肌细胞间电连接形式，调控着细胞新陈代谢、内环境稳态、增殖和分化等生理过程；缝隙连接蛋白43（connexin 43，Cx43）是构成心室间隙连接的主要结构蛋白，其正常表达和分布是心脏正常电活动和协调舒缩的重要保证［1］。已有报道，Cx43蛋白参与了急慢性心肌缺血、心力衰竭、心律失常、高血压诱导的心肌肥厚等的发生发展过程［2］。

法舒地尔（fasudil，Fas），是临床最常用的 Rho特异性卷曲螺旋形成相关蛋白激酶（Rho associated coiled-coil forming protein kinase，ROCK）的抑制剂；已有报道，Fas可以抑制高血压、血管紧张素II（AngII）诱导的心肌肥厚，对抗慢性高血压导致的充血性心力衰竭；心肌肥厚最终可导致心力衰竭，防止心肌肥厚对治疗心力衰竭有重要意义［3］。本实验采用腹主动脉缩窄（transverse aortic constriction，TAC）诱导大鼠心肌肥厚模型，观察心肌肥厚大鼠心肌Cx43的表达变化及法舒地尔的干预作用。

1 材料与方法

1.1 药品及试剂

盐酸法舒地尔注射液（天津红日药业股份有限公司，批号 1301241，15 mg／ml），戊巴比妥钠，兔抗 Cx43抗体（cell signaling technology公司），其他试剂均为分析纯。BMJ-型包埋机（常州中威电子仪器厂），切片机（德国 LEICA2135），超速低温离心机（Beckman，美国），722分光光度计（上海第三分析仪器厂），自动组织脱水机（Leica公司），显微镜及其成像系统。

1.2 动物模型制备及治疗给药

健康Wistar雄性大鼠43只，体重（186±28）g，购于上海西普尔-必凯实验动物公司，合格证号2012001213432，饲养环境：温度：（25±2）℃，湿度：55%～60%，早晨8点开日光灯，下午5点关日光灯；分笼饲养。编号后，按照随机表法抽取10只作为假手术组（Sham组），余33只随机分为腹主动脉缩窄模型组（TAC模型组）、TAC组＋低剂量Fas组、TAC组＋高剂量Fas组。用0.5%戊巴比妥钠45 mg／kg ip麻醉。沿腹白线开腹，分离腹主动脉，在肾动脉上方0.5 cm处用直径0.70 mm银夹夹闭，使腹主动脉缩窄60%～70%，确认无出血、脏器复位后关腹，制成压力超负荷心肌肥厚模型。Sham组大鼠操作方法同上，但不TAC。从TAC术后分别给予盐酸Fas注射液10、40 mg／kg ip，每天1次。Sham组和 TAC模型组分别每天给予同等容量的无菌注射用水ip，每天1次，治疗8周。

1.3 切片染色检测

治疗结束处死大鼠，取心脏心尖左心室于10%的福尔马林（PH10）的固定液中，依据HE染色步骤，将大鼠心肌切片HE染色，85℃烤箱内烤片10 min；置于二甲苯中浸泡10 min，更换二甲苯后再浸泡10 min，水洗；放入1%的苏木素染液中染色2 min；1%盐酸酒精分色及流水冲洗反蓝；放入0.5%伊木红染液中染色2 min，流水冲洗后放入双蒸水，上行脱水，中性胶封片。光镜下观察心肌组织形态学改变。

1.4 Envision二步法免疫组化检测Cx 43蛋白表达

切片脱蜡至水、孵育、加一抗、苏木精染色、切片经梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明、中性树胶封存，晾干后观察。将800×光镜下，各组切片分别选取5个视野，每组6张切片（n＝6），利用 Image Pro Plus（IPP）6.0版本软件，根据染料颜色的深浅的值和阳性表达面积来确定Cx43蛋白的量，测量图片阳性表达面积（area）和平均光密度（OD）值。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 大鼠一般情况

实验期间，TAC模型组大鼠死亡4只，Fas小剂量组死亡2只，Fas大剂量组死亡1只，Sham组大鼠活动良好。到实验结束时，存活大鼠共36只。死鼠解剖主要死因与心衰有关。术后第一周，四组动物均活动减少、自洁情况差、摄食及饮水量减少，二周后逐渐好转。整个实验期间，Sham组大鼠毛色光泽，行动灵敏，对周围环境反应迅速；TAC模型组大鼠后期毛色失去光泽，精神萎靡，行动迟缓；Fas组大鼠一般状况较TAC模型组好。

2.2 大鼠病理切片观察

观察图1可见，HE染色后，光镜下Sham组细胞大小形态无变化，心肌纤维排列整齐；TAC模型组心肌细胞排列不规整，紊乱，心肌纤维肥大增粗，肌纤维间隙疏松水肿，间隙增宽，组织中可见炎症细胞浸润，Fas组病理改变与TAC模型组相比改善较明显，心肌纤维束缩小，心肌细胞排列渐趋于整齐，肌纤维间隙缩小，组织中炎症细胞浸润。

Fig.1 Changes of histology in the myocardium of rat（HE×200）A：Sham group；B：Transverse aortic constriction（TAC）model group；C：Fas 10 mg／kg group；D：Fas 40 mg／kg group

2.3 免疫组化半定量Cx43蛋白表达量

Envision法免疫组化显示棕黄色为Cx43蛋白表达染色，紫色为细胞核，Sham组阳性着色点分布规律且广泛，多分布于心肌纤维连接处及闰盘部位，TAC模型组可见大量蓝色的细胞核，少量的棕黄色阳性表达，Cx43颗粒变小，主要分布在心肌细胞两侧，呈“侧边化”现象，Fas治疗组着色颗粒明显，分布较TAC模型更有序，10 mg／kg和40 mg／kg组间差异明显（图 2）。

Fig.2 Expression of Cx43 in left ventricular of rat（Envision×200）

3 讨论

显微镜下TAC模型组心肌细胞排列紊乱，肥大，间隙增宽，炎症细胞浸润；Fas治疗后，上述改变明显缓解，40 mg／kg-Fas组大鼠一般状况较TAC模型组好，整体死亡减少，说明Fas对TAC大鼠心肌肥厚有治疗作用。

心肌细胞间信息的正常传递是维持其电生理活动的重要保证，主要通过缝隙连接来实现。正常心肌细胞缝隙连接蛋白Cx43主要表达于相邻细胞的连接处及闰盘部位，呈旌状或阶梯状排列。其表达正常和分布是心脏正常电活动维持和舒缩功能协调的必要条件。本研究中发现正常对照组大鼠心肌细胞间有不少Cx43表达，多表达于相邻细胞的连接处及闰盘部位；而TAC模型组大鼠心肌细胞间Cx43表达显著减少，多分布在心肌细胞两侧，提示Cx43可能参与TAC大鼠心肌肥厚的发生或发展过程，这与有关文献报道相吻合；结合近年来相关的研究报道，我们认为Cx43表达减少是：（1）Cx43蛋白降解增加，是心肌缺血时最易降解的结构蛋白之一，而大鼠心肌肥厚病变易诱导心肌慢性缺血。（2）已有报道，体内及体外诱导心肌肥厚后的心肌Cx43蛋白表达下调［4］，且Cx43 mRNA表达下调，表明肥大心肌的Cx43蛋白合成减少。（3）Cx43不能形成有效的缝隙连接通道，无法进行有效的细胞间信号传导［5］。本实验结果显示，40 mg／kg Fas治疗后，明显降低心肌肥厚大鼠死亡率，同时大鼠心肌组织Cx43蛋白表达显著升高，可能有助于缓解心肌肥厚大鼠心力衰竭，有望临床用于心肌肥厚及心力衰竭的治疗。Fas如何影响Cx43表达，其进一步机制需后续研究。

［1］ Solan JL，Lampe PD.Connexin43 phosphorylation：structural changes and biological effects［J］.Biochem J，2009，419（2）：261-272.

［2］ Jeyaraman MM，Srisakuldee W，Nickel BE，et al.Connexin43 phosphorylation and cytoprotection in the heart［J］.Biochim Biophys Acta，2012，1818（8）：2009-2013.

［3］ Duerr GD，Heinemann JC，Dunkel S，et al.Myocardial hypertrophy is associated with inflammation and activation of endocannabinoid system in patients with aortic valve stenosis［J］.Life Sci，2013，92（20-21）：976-983.

［4］ 尚 好，钱雅珍，陶厚权，等.贯叶连翘提取物对扩张型心肌病大鼠缝隙连接蛋白Cx43的影响［J］.中国应用生理学杂志，2013，29（4）：330-332.

［5］ 毛斐斐，朱有法，王 钰，等.伊贝沙坦和培垛普利对左心室肥大时心肌连接蛋白43、结蛋白与肌钙蛋白T表达的实验研究［J］.中国病理生理杂志，2005，21（8）：1552-1556.