胰岛素诱导的低血糖大鼠下丘脑增食欲素-A的表达*

赵 琳，贾鲲鹏，王 璐，陈美霓，王亚萍，杨彦玲

（1.延安大学医学院，2.延安大学附属医院，陕西 延安716000）

增食欲素-A（orexin-A）是下丘脑合成和分泌的具有神经兴奋作用的神经肽，参与摄食、能量代谢、应激等生理活动的调节。Orexin-A神经元属于葡萄糖敏感型神经元，血糖的下降可以刺激下丘脑外侧区（later hypothalamus area，LHA）的orexin-A神经元。但是低血糖应激状态下orexin-A的表达变化如何，orexin-A与胰岛素之间的相互影响并不清楚。本实验采用胰岛素诱导的急性低血糖大鼠模型，研究下丘脑orexin-A的表达变化。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

小鼠抗orexin-A抗体购自英国Abcam公司；生物素标记的驴抗小鼠血清购自美国Chemicon公司；AB复合物购自美国Vector公司；DAB显色剂试剂盒、显影液和封片剂购自中国北京中杉公司。

1.2 实验动物和分组

健康成年SD大鼠24只（雄性，250～300 g），由延安大学医学院实验动物中心提供，随机分为三组（n＝8）。低血糖进食组大鼠皮下注射胰岛素（50 U／kg），自由进食和饮水；低血糖禁食组大鼠皮下注射胰岛素（50 U／kg），禁食5 h，但可自由饮水；正常对照组大鼠不予任何处理，动物正常进食、饮水。

1.3 灌注与取材

造模5 h后，用2%异戊巴比妥钠（40 mg／kg）腹腔注射麻醉，之后断尾取血用微型血糖仪测定血糖，用化学发光法检测血清胰岛素水平。补加戊巴比妥钠（至80 mg／kg）深麻大鼠，剪开胸骨，经升主动脉插管，剪开右心耳，先用100 ml生理盐水快速冲血，用4%多聚甲醛（pH 7.4）持续灌注1 h左右，取脑，置入30%蔗糖溶液（pH 7.4），4℃冰箱过夜。取下丘脑部分（乳头体至视交叉）行冰冻切片。

1.4 免疫组化染色

切片经 0.01 mol／L PBS（pH 7.4）反复漂洗 3次；加入0.3%H2O2消除内源性过氧化物酶，正常山羊血清封闭液室温封闭1 h；滴加小鼠抗 orexin-A IgG（1∶100），室温孵育过夜；生物素标记的驴抗小鼠血清（1∶200），室温4～6 h；AB复合物（1∶200），室温 1～2 h。以上各步之间均用 0.01 mol／L PBS漂洗30 min×3次。经以上孵育后，用DAB显色剂进行呈色、裱片，第二天乙醇梯度脱水、二甲苯透明、封片。

1.5 灰度值测量和统计学处理

每只动物选取3张典型切片进行orexin-A阳性神经元的计数及灰度值测量，orexin-A免疫阳性产物的灰度值测量采用Photoshop 7.0分析工具。实验数据以均数±标准差表示，采用SPSS16.0统计软件行 t检验。

2 结果

2.1 胰岛素的比较

低血糖进食组血糖低于正常对照组，而低血糖禁食组血糖下降更明显。血清胰岛素水平在低血糖进食组和低血糖禁食组都明显升高 （P＜0.05，表 1）。

Tab.1 Comprision of the levels of serum glucose and insulin in rats，n＝8）

Tab.1 Comprision of the levels of serum glucose and insulin in rats，n＝8）

Group Glucose（mmol／L） Insulin（mIU／L）Control 7.91±0.52 20.51±1.83 Hypoglycemia with feeding 4.20±0.64* 326.82±8.25*Hypoglycemia with fasting 1.92±0.35* 275.98±7.46*

2.2 免疫组化染色

Orexin-A免疫阳性产物在对照组、低血糖进食组和低血糖禁食组都有不同程度的表达，涵盖下丘脑穹窿周区、腹外侧、背侧和后区，低血糖禁食组在穹窿周区表达较密集，细胞呈梭形和卵圆形，局部区域有团块状深染产物堆积。Orexin-A阳性神经元的个数平均值在低血糖禁食组为（90±12），明显多于对照组（49＋6）（P＜0.05），低血糖进食组（54＋8）与对照组比较没有统计学差异（图1）。

Fig.1 Expression of orexin-A in perifornical hypothalamus by immunohistochemical staining（Bar＝200μm）

2.3 灰度值测量

Orexin-A阳性神经元平均灰度值比较，低血糖进食组（121＋14）与对照组（126＋16）比较没有明显变化，而低血糖禁食组灰度值较低，为98±17，与对照组比较有明显变化（P＜0.05），显示 orexin-A染色强度最高（图 2）。

Fig.2 Comparison of averaged grey value for orexin-A immunopositive neurons

3 讨论

Orexin包括orexin-A和orexin-B两个单体，因orexin-A具有二硫键环化多肽，所以生化结构更为稳定，在觉醒和能量平衡中起着重要作用。LHA是一个经典的涉及哺乳动物摄食行为调控的区域，是下丘脑食欲调节的“网络中心”之一［1］。给大鼠侧脑室、LHA和穹隆周区注射orexin-A，可显著提高其进食量［2］。Orexin最初是在LHA及其周围区域发现的，LHA损伤可降低动物随机进食，并可降低禁食和胰岛素诱导的低血糖所导致的食欲亢进。也有研究发现低血糖伴有禁食可以损伤LHA，影响LHA某些区域的神经元功能，并且在应答禁食的情况下下丘脑prepro-orexin mRNA水平是增加的［3］。

Orexin神经元属于葡萄糖敏感型神经元，血糖升高可以抑制它们的功能，血糖下降可以刺激 LHA的 orexin神经元［4］，前期的研究发现，禁食可以促进下丘脑orexin-A神经元的表达［5］。本实验结果显示：大鼠皮下注射胰岛素，血糖低于对照组，在低血糖禁食组下降更明显。血清胰岛素水平在低血糖进食组和低血糖禁食组都明显升高。对照组和急性低血糖组大鼠下丘脑都呈现不同程度orexin-A表达，而在低血糖禁食组，orexin-A的表达明显增加，灰度值比较也显示其染色强度最高，而低血糖进食组orexin-A表达和灰度值与正常对照组比较都没有明显变化，表明急性葡萄糖水平下降可激活下丘脑的orexin-A神经元，但这种应激可被与进食相关的信号迅速的抑制。

Griffond等［6］研究发现，胰岛素介导的急性低血糖应激可促进大鼠orexin的表达，但这种刺激作用在血糖升高时消失。胰岛素与orexin的相互调控可能涉及多方面的因素，血清胰岛素、血糖及脂代谢变化，其他代谢和内分泌敏感因素都可能参与了orexin的调节。另外orexin类神经元对血糖减少的刺激并不是十分强烈，在慢性限食时，中枢神经系统（central nervous system，CNS）就会使神经元适应的利用酮类，部分代偿葡萄糖减少所引起的兴奋作用。下丘脑orexin系统是血糖下降时被活化的葡萄糖感觉网络的一部分，orexin神经元被急性低血糖激活，又被与进食相关的信号抑制。Orexin神经元在维持葡萄糖可获得性的血糖稳态进食机制中显示着十分重要的地位。

［1］ Abizaid A，Horvath TL.Brain circuits regulating energy homeostasis［J］.Regul Pept，2008，149（1-3）：3-10.

［2］ Okumura T，Takakusaki K.Role of orexin in central regulation of gastrointestinal functions［J］.J Gastroenterol，2008，43（9）：652-660.

［3］ Cai XJ，Evans ML，Lister CA，et al.Hypoglycemia activates orexin neurons and selectively increases hypothalamic orexin-B levels：responses inhibited by feeding and possibly mediated by the nucleus of the solitary tract［J］.Diabetes，2001，50（1）：105-112.

［4］ Satoh Y，Okishio Y，Azuma YT，et al.Orexin A affects ascending contraction depending on downstream cholinergic neurons and descending relaxation through independent pathways in mouse jejunum［J］.Neuropharmacol，2006，51（3）：466-473.

［5］ 赵 琳，贾鲲鹏，史 娟，等.禁食不同时段下丘脑穹窿周区orexin-A的表达［J］.中国组织化学与细胞化学杂志，2012，21（6）：563-566.

［6］ Griffond B，Risold PY，Jacquemard C，et al.Insulin-induced hypoglycemia increase preprohypocretin（orexin）mRNA in the rat lateral hypothalamic area［J］.Neurosci Lett，1999，262（2）：77-80.