农杆菌介导法转化小麦的研究进展

2014-01-22杨丽娟蒋志凯刘朝辉赵宗武

种业导刊 2014年10期

关键词：幼穗外植体侵染

杨丽娟，盛坤，蒋志凯，刘朝辉，赵宗武

（新乡市农业科学院，河南新乡 453000）

农杆菌介导法转化小麦的研究进展

杨丽娟，盛坤，蒋志凯，刘朝辉，赵宗武

（新乡市农业科学院，河南新乡 453000）

农杆菌介导法具有操作简便、成本低、实用性强等诸多优点，广泛应用于小麦遗传转化。综述了农杆菌介导法转化小麦的敏感基因型筛选、外植体类型选择及转化体系优化方面的研究进展，对农杆菌介导法转化小麦前景进行了展望。

农杆菌；遗传转化；小麦

小麦是重要的粮食作物，利用植物基因工程技术进行小麦遗传改良，增强小麦抗病虫和耐逆境能力，提高产量，改善品质，是小麦遗传育种的研究方向之一。当前，用于小麦遗传转化的手段主要有基因枪法、农杆菌介导法和花粉管通道法。农杆菌转化法具有基因拷贝数低、转基因沉默相对较少、转移的基因片段较长、转化效率高等优点（徐春晖等，2002）。根癌农杆菌在土壤中含量极其丰富，能在植物组织中生长。农杆菌介导法是目前应用最为广泛的植物转化方法。

伴随着农杆菌介导的粳稻遗传转化体系日趋成熟，单子叶植物目前也能够用这种方法进行转化（Hamid等， 1994； Ye等， 2000）。农杆菌介导的转基因方法具有操作简单、成本低，受体范围广等特点，但农杆菌介导法也存在一定不足，如易受基因型特异性，宿主范围的限制，再生细胞感受态与转化细胞感受态不一致性和易导致检测结果假阳性等，农杆菌介导法转化小麦有待于建立并完善其高效转化体系。

1 敏感基因型筛选

小麦高频再生系统是提高转化率的首要保证，其中受体基因型是影响转化率的重要因素。不同小麦基因型对农杆菌侵染的敏感程度不同，筛选对农杆菌敏感的小麦基因型对于小麦新品种选育和功能基因组研究具有重要意义。优良小麦品种成熟胚再生性能和农杆菌敏感性评价为进一步利用细胞工程和基因工程途径改良小麦奠定了基础。

Bobwhite是常用的基因型（杨云霞，2005；王艳丽2006；衣大龙，2009）。王艳丽等（2005）利用含GUS基因的C58C1农杆菌菌系转化83个小麦基因型的幼穗，发现CA9924、北农49、西农2611、京冬11等基因型幼穗对农杆菌侵染比较敏感；但农杆菌侵染后小麦幼穗切段仅仅不断膨大，几乎不产生愈伤组织，难以获得再生植株。张彬（2006）等人以3个栽培冬小麦品种运丰优、临优145、中优9507的成熟胚愈伤组织为外植体研究发现，三种小麦基因型对根癌农杆菌的敏感性存在显著差异，以临优145最敏感。后猛（2008）以100份普通小麦品种（系）和4份二倍体及四倍体小麦为实验材料，进行成熟胚愈伤组织诱导及分化再生的研究，筛选出了愈伤组织出愈率高、愈组质量好、分化能力强、成苗率高的山农2618等多个优良基因型材料。陶丽莉（2009）根据农杆菌侵染后胚性愈伤组织诱导率和抗性植株再生率，从41个小麦品种中筛选到了比较适合农杆菌介导遗传转化的CB037、06SKW28、邯6172、豫麦66、新春9号、轮选987、CA8694等基因型，其胚性愈伤组织诱导率都在10.0%以上，抗性植株再生率均高于2.0%。李欣（2012）等研究了12个优良小麦新品种成熟胚再生率及其对农杆菌侵染的敏感性，认为周麦27、扬麦19等品种适合进行成熟胚培养，周麦18、扬麦15等品种成熟胚适合进行农杆菌转化。杨赛奇（2012）初步根据幼胚愈伤组织的组培特性对黄淮麦区95种主流普通小麦栽培品种进行聚类分析，将所有基因型划分成7个类群，不同小麦基因型对农杆菌侵染的敏感程度不同，其中有一个类群有较好的组培特性。

2 外植体类型选择

许多外植体都被尝试用于小麦组织培养再生体系，包括幼胚、成熟胚、盾片、幼穗、幼叶、分生组织、根尖等。截至目前，小麦幼胚是农杆菌介导法转化小麦的常用外植体，高效离体再生体系的建立是小麦遗传转化的关键所在，外植体选择是重要环节。小麦幼胚培养力高、植株再生能力强，被认为是最理想的外植体材料，但小麦幼胚的取材受季节严格限制，而且存在着基因型单一、转化效率不稳定等缺点，并且农杆菌侵染后导致小麦幼胚愈伤组织褐化死亡现象严重，一定程度制约了小麦基因工程育种和功能基因组研究的深入。

小麦成熟胚取材方便，不受季节、环境条件和植株发育状况等因素的限制，个体间生理状态一致，是开展小麦遗传转化较为方便的外植体。但是，小麦成熟胚植株再生率非常低，限制了成熟胚在小麦遗传转化中的应用。但目前已有许多农杆菌转化成熟胚的成功尝试（Khurana等，2002； Patnaik等，2006； Ding等， 2009； Wang等， 2009）。

许多研究者用幼穗和花药作为农杆菌转化的外植体并获得了成功。高春生（2006）等研究了在不同诱导和分化条件下幼穗愈伤组织诱导再生频率及其差异，结果表明中部穗段是最好的外植体。陈梁鸿等（1999）利用基因枪转化小麦幼穗愈伤组织，将EPSPS基因转入了小麦，获得了转基因植株。赵爱菊等（2011）采用农杆菌介导法对小麦花药愈伤组织进行转化，结果表明不同基因型的花药培养力存在显著差异，其中小麦品种石4185和冀5265是小麦花药农杆菌转化的良好受体基因型。张艳敏等（2003）以石4185、石6365的花药愈伤组织为受体，进行了甜菜碱醛脱氢酶和胆碱氧化物酶等目的基因的转化，PCR检测到阳性抗性再生植株。Amoah等（2001）利用农杆菌侵染小麦幼穗，研究了影响GUS基因在幼穗中表达的因素，但最终没有获得转基因植株。黄益洪等（2002）分别以小麦幼穗和花药为受体材料，利用不同农杆菌菌株感染，发现农杆菌菌系、小麦基因型和外植体对转化效果均有影响，幼穗侵染后GUS基因瞬时表达率高于花药。

多人研究结果表明农杆菌可以侵染小麦植株（Hess等，1990； Mooney等， 1991；Langridge等，1992）。何道一等（2003）首次报道利用小麦开花期农杆菌滴入小花的方法获得了转基因小麦植株。Zale等（2009）在小麦孕穗期将穗子从叶鞘中剥出，在农杆菌菌液中浸泡1～2min，下一代经巴龙霉素筛选和PCR、Southern检测，证明获得了转基因植株。

Razzaq等（2005）将萌芽的小麦种子剥去胚芽鞘，暴露生长点，细针刺伤生长点后利用农杆菌侵染，获得了阳性植株。Supartana等（2006）将小麦种子在水中浸泡1d，用蘸有农杆菌的细针穿刺芽尖部位，2d后灭菌和春化处理，Southern杂交鉴定出5个农艺性状表现差异的转基因株系。Zhao等（2006）以小麦茎尖为受体，获得了带有β-1，3-葡聚糖酶基因的抗白粉病植株。梁欣欣等（2007）利用农杆菌感染小麦幼苗茎尖，经在含有除草剂的培养基上筛选得到了抗性植株，进一步对抗性植株进行了PCR检测。杨波等（2008）对不同苗龄小麦幼苗茎尖部位进行刺伤后侵染处理30min时，其茎尖uidA基因瞬时表达率可达31%。

Risacher等（2009）描述了一种利用农杆菌在植株上注射小麦未成熟籽粒的转化方法，平均转化率5%以上，30%～50%的转化植株为单拷贝整合，转基因植株农艺性状正常。

3 转化体系优化

3.1 建立高效转化体系

影响转化效率的因素有菌株染色体背景、共培养方式、侵染浓度和时间、共培养条件、受体类型和生理状态、预培养培养基、接种方式、感受态细胞保存条件、植物基因型、靶细胞生理状态及对转化植株的筛选程序、外植体处理、再生筛选体系等因素。在受体基因型和受体类型限定的情况下，筛选剂种类和剂量、预处理方式、侵染时间等成为转化体系优化的几个重要影响因素。

Ding等（2009）利用含pBI121载体的LBA4404农杆菌侵染小麦成熟胚，以组织化学染色检测和分子检测结果为依据，对农杆菌转化的影响因素进行了探讨，认为干燥条件下共培养有利于农杆菌对小麦细胞的侵染。张志清等（2006）使用川农16、川麦32和川育16幼胚及愈伤组织，对农杆菌介导遗传转化中几个重要影响因素进行了研究，结果表明Kan不能抑制幼胚愈伤的生长，G418不能很好地抑制住幼胚生长，在小麦遗传转化诱导愈伤和继代阶段L-PPT合适的筛选浓度是2～3mg/L。

3.2 辅助措施提高转化效率

对转化细胞进行电击，利用高压脉冲作用使细胞膜上形成可逆性的瞬间通道，从而使外源DNA分子进入细胞，操作简便、转化效率高，电击与农杆菌介导法结合使用可以提高转化效率。接种时振荡培养能打破细胞表面的气泡，使农杆菌与外植体的接触面增大，有利于农杆菌侵染。席梦利等（2007）以杉木茎段为外植体置于侵染液中浸泡进行振荡接种获得了抗性芽。该方法在小麦遗传转化中的有效性尚未见报导，但可为提高农杆菌转化效率提供参考。于慧敏等（2005）利用GUS基因的瞬时表达研究了农杆菌介导的胚性愈伤组织小麦遗传转化，结果表明超声波处理30s与适宜的菌液浓度、侵染时间等因素的作用下可使转化效率得到明显提高。综合利用这些优化的转化条件，可使小麦的瞬时转化效率提高3倍多。毕瑞明（2008）研究表明，在接种侵染过程中的负压处理对小麦成熟胚愈伤组织的诱导没有显著影响，但对小麦成熟胚的遗传转化却有显著影响，负压处理后转化率最高较对照组提高了10.90倍，最高转化率可达12.50%，同时能够提高小麦成熟胚转化效率。王旭明等（2012）报道了一种超声波辅助的农杆菌转化法，将发芽的小麦种子经超声波处理20min后再经农杆菌浸染，4个小麦品种均得到抗性后代，而不经超声波处理的种子几乎看不到转化的细胞，而经过超声波处理的种子，幼苗基部的细胞转化成功。利用超声波辅助的农杆菌转化方法转化小麦能产生可遗传的后代。

4 发展前景

目前已经有多种目的基因以农杆菌转化法转入到小麦中（薛哲勇等，2004；奚亚军等，2004；毕瑞明等，2006；刘伟华，2006；李林等，2011；黄望启，2012）。农杆菌介导法操作简便、成本低、实用性强。此法可以转移较大的DNA片段，而且所转DNA很明确的为T-DNA左右边界之间的序列。其基因插入的低拷贝性，有利于克服基因失活现象，转化比较温和。农杆菌介导法不需要原生质体培养再生的过程，其转化受体可以是不同的植物组织。以上诸多优点，使农杆菌介导法成为最具竞争力的转化方法，农杆菌介导法将代替基因枪法，成为转基因研究的主体（周文麟等，1992）。基因枪法与农杆菌法相结合的“Agrolistic”法，利用碳化硅纤维辅助的农杆菌法，超声波辅助的农杆菌法以及农杆菌法与病毒相结合的“Agroinfection”法等，都可不同程度提高农杆菌的转化率，在小麦遗传转化中的应用也必将越来越广泛。

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