TBX6基因与先天性脊柱畸形的研究进展*

刘嘉琦 刘森 吴南 邱贵兴 吴志宏

（中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院骨科，北京 100730）

TBX6基因与先天性脊柱畸形的研究进展*

刘嘉琦 刘森 吴南 邱贵兴 吴志宏**

（中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院骨科，北京 100730）

先天性 脊 柱畸形（congenital vertebral malformations，CVM）是一类严重影响人类健康的疾病，临床上可表现为先天性脊柱侧凸、脊柱后凸等，患者可有颈背痛、呼吸衰竭、活动能力下降等表现，严重时可丧失劳动能力，给家庭和社会带来极大负担。有报道称其发病率为 0.5～1.0/1000 个新生儿[1]，但很多 CVM 患者并无临床表现而未被发现，因而真实比例可能不限于此[2]。在临床上，CVM 既可作为单独畸形出现，也可合并有肾、心、脊髓等其他脏器畸形，还有一些综合征包含有 CVM，常见的有：Klippel-Feil综合征（表现为短颈畸形、后发际低、颈椎融合等），Alagille 综合征（表现为累及肝、心、骨骼、眼睛和颜面等多器官的显性遗传性疾病），脊柱肋骨发育不全（spondylocostal dysostosis，SCD，表现为侏儒，短躯干，多发的椎体和肋骨畸形），脊柱胸廓发育不全（spondylothoracic dystrophy，STD，表现为 SCD 基础上合并有肋骨后部融合），Goldenhar综合征（表现为眼球皮样囊肿、耳畸形和脊柱畸形，偶见心脏和神经系统等的发育缺陷）和VACTERL综合征（表现为脊柱畸形、肛门闭锁、心脏畸形、食管气管瘘、肾畸形、胫骨畸形和肋骨缺陷）等。临床上常根据 Hedequist等[3]提出的分型，将脊柱发育异常导致的脊柱畸形分为椎体形成障碍（半椎体、楔形椎和蝴蝶椎）、分节不良（椎体融合）和混合型 三 类 。 近 来 ICVAS（International Consortium for Vertebral Anomalies and Scoliosis）组织又根据脊柱畸形的表现和分子生物学特征提出了新的分型[4]，越来越多的研究着眼于CVM临床表型与分子遗传学改变间的关系，其中TBX6基因突变引起的CVM被越来越多的研究所关注。本文将对近年来TBX6基因与先天性脊柱畸形的基础和临床研究做一归纳总结，以期对CVM的病因学研究提供帮助。

1 先天性脊柱畸形的遗传学研究基础

CVM归因于胚胎期的轴旁中胚层、体节或中轴骨发育异常。脊椎动物胚胎的轴旁中胚层在发育特定时间由头到尾断裂成团块状细胞团的过程称为体节形成（somitogenesis），其发育过程受 Wnt、FGF 和Notch等信号通路调节，体节发育时间具有种系特异性，人类发生的周期在受精后 8 h，体节在脊索和神经管双侧，沿前后轴成对对称分布。每个体节最后发育成熟形成三层：生皮节、生肌节和生骨节，并在此基础上分别衍生出真皮、骨骼肌和中轴骨，中轴骨发育为椎体。因此，在胚胎发育过程中任何对于轴旁中胚层、体节和中轴骨发育过程的影响都可能导致CVM[5]。

CVM的产生是遗传与环境因素共同作用的结果。早在1973年就有实验表明小鼠孕期暴露于苯妥英环境会增加子代 CVM 发生率，Giampietro 等[6]通过回顾和对比来自多中心的228例CMV患者和268例脊柱表型正常或仅有微小侧凸患者母方的孕期暴露因素，发现增加CVM患病率的首位因素为母方的胰岛素依赖型糖尿病史或妊娠期糖尿病史，其次为双胞胎，此外具有统计学意义的暴露因素还包括吸烟、饮酒、抗惊厥药物、缺氧、高温环境或人工受精等，与之前的研究结论较一致，虽然这些因素与CVM发生相关性的定量研究尚未报道，但这可能提示CVM高危环境因素的预防可能成为重要的研究方向之一[7]。

CVM的遗传模式尚无定论，但目前的研究支持多基因遗传[8]。CVM 中 SCD 与 STD 的遗传方式已有较明确报道。SCD主要特点为脊柱分节缺陷和肋骨畸形，患者常表现为身材矮小、脊柱侧凸和呼吸功能受限，曾报道其遗传模式大部分为常染色体隐性遗传 ，相 关 的 基 因 包 括 DLL3[9]、MESP2[10]、LFNG[11]和HES7[12]，也有少数为常染色体显性遗传，有报道提出相关基因可能为 TBX6[13]；STD 临床表现上较 SCD 更为严重，除SCD的表现外还具备后肋部融合，被称为“蟹足胸”（crab like thorax），目前仅有 MESP2 被报道与其相关[14]。CVM 多为散发，而且即使在一个家系中其致病基因也不尽相同，同一基因致病的患者表型也不相同，对散发家系的基因测序中发现的与CVM 可 能 相 关 基 因 还 包 括 PAX1[15]、DLL3[16]、SLC35A3[17]和 T（Brachyury）[18]。其中，近年来越来越多的文献报道指出TBX6基因可能是CVM的重要致病基因之一。

2 TBX6基因的作用机制

TBX6 基因全称为 T-boχ 6，是 T-boχ家族的一员，T-boχ基因家族主要由具有保守的DNA结合区的转录因子组成，在胚胎发育早期和器官形成中发挥重要作用，其突变可引起严重的先天畸形[19]，如：TBX1基因杂合性缺失可引起CATCH22综合征（表现为心脏缺陷、异常面容、胸腺发育不良、腭裂、低钙血症和22号染色体缺失），TBX3 基因突变导致尺骨-乳房综合 征（ulnar-mammary syndrome），TBX5 基 因 突 变 则引起心手综合征（Holt-Oram syndrome）。TBX6 位于16p11.2，坐标为 16[19]，其大小为 6095 bp，包含 8 个外显子，其编码一个436个氨基酸组成的蛋白，大小为47045 Da。TBX6 基因在小鼠基因组的同源基因是位于 7 号染色体的 Tbχ6 基因[20]。在斑马鱼基因组，尽管先前研究发现其tbχ6基因和小鼠Tbχ6基因在序列上有相似性，但 Ann 等[21]通过最大似然法比较序列与蛋白质结果，推翻了前人的结论，提出斑马鱼12号染色体的 tbχ24 基因更可能是小鼠 Tbχ6 的同源基因，而tbχ6更可能为小鼠Tbχ16的同源基因。

Chapman 等[20]于 1996 年报道了小鼠 T-boχ家族的基因Tbχ6具有编码DNA结合蛋白的功能。Tbχ6在小鼠发育过程的表达起始于 7.0 dpc 在胚胎卵圆柱（egg cylinder），对应早期原条（primitive streak）呈线样分布，在 7.5 dpc，Tbχ6 在原条尾端和原条周围的轴旁中胚层表达，在 8.5 dpc，Tbχ6 开始围绕在尾端神经板周围在未分节的原体节中胚层（presomitic mesoderm）表达，Tbχ6 在尾芽（tailbud）的表达持续至 12.5 dpc，在13.5 dpc 后检测不到 Tbχ6 的表达。因此推测 Tbχ6 在原条、尾芽和原体节中胚层的表达在发育中起重要作用。小鼠肋骨-脊柱畸形突变基因 Tbχ6rv是 Tbχ6 的等位基因[22]，该突变表现为椎体融合、肋骨融合及分叉。Chapman 等[23]于 1998 年在 Nature 发文报道了其制备的Tbχ6突变小鼠轴旁中胚层受到影响，证明了Tbχ6在体节形成调控中的作用。研究通过胚胎干细胞内源性重组，敲除了 Tbχ6 起始的蛋氨酸等部分来建立 Tbχ6 突变等位基因 Tbχ6tm1Pa，Tbχ6/Tbχ6tm1Pa杂合子可以存活并且有生殖能力，在杂合子相互交配产生的94个后代中没有发现纯合突变小鼠。在Tbχ6纯合突变的小鼠胚胎中，E8.5就可以观察到体节形成的异常，在 E9.5 和 E10.5 时出现尾牙增大并充满未分化的间充质细胞；轴旁组织没有发育为体节而在神经管两侧形成类似神经管的结构。在增大的尾牙和异常体节中，体节形成标志蛋白如 DLL1、paraχia 和Moχ-1 等均表达异常。在斑马鱼的研究中，van Eeden等[24]报道了突变体“fused somites”（fss）会出现整个体节的发育缺陷，后续研究发现，其对体节的调控过程不依赖 Notch 信号通路，其编码的 T-boχ转录因子在PSM 发 育 中 起 重 要 作 用 ，Nikaido 等[25]将 其 命 名 为tbχ24，是 Tbχ6 在斑马鱼的同源基因。Yi等[26]与 Papapetrou 等[19]分别于 1999 年在人类基因中找到 Tbχ6 的同源基因TBX6，两者相似度达84%，并将其定位在16q11.2区域，并证实TBX6除在人类胚胎发育过程中有小鼠发育过程类似表达外，成年后还在很多组织（如睾丸）中持续低剂量表达。

目前对Tbχ6作用机制的研究主要集中于两个方面：①转录因子Tbχ6 与 Soχ2 共同调节轴细胞向神经管和轴旁中胚层的分化[27]；②Tbχ6 通过调节 Notch 通路的 部分基因转录 ，通过影响下 游 Dll1、Mesp2 和Ripply2 基因的表达来影响脊柱的发育。

Takemoto 等[28]于 2011 年在 Nature 发表文章阐述了小鼠Soχ2基因依赖Tbχ6的调控决定轴向干细胞的命运。在野生型小鼠胚胎内，神经发育的起始基因Soχ2的增强子N1在尾侧外胚层两侧被激活，使得细胞保持在神经板表层并维持 N1活性与 Soχ2 的表达。与此同时，将发育为中胚层的细胞激活 Tbχ6 并关闭增强子N1，随后迁移至轴旁中胚层。在Tbχ6突变体内，N1增强子在轴旁中胚层内持续被激活，因而异位激活Soχ2并导致轴旁中胚层发育为神经管。将N1增强子特异性突变引入该Tbχ6突变体胚胎后，避免了 Soχ2 的异位激活和其后神经管的异常发育，这提示 Tbχ6 可能通过 N1 增强子对 Soχ2 的调控起作用。Tbχ6依赖的Wnt3a基因在轴旁中胚层受抑制也在此调解过程中起作用。对野生型小鼠轴旁中胚层转入异常表达的Soχ2基因后，也得到了神经管异位发育的结果。这与先前报道的斑马鱼模型中轴细胞向神经干细胞和中胚层分化受Wnt信号通路调控过程非常相似[29]。

Tbχ6 基因突变也可通过异常调节 Mesp2 和 Ripply2基因的表达导致 CVM。Tbχ6调节 NOTCH信号通 路 的 直 接 靶 位 点 是 Dll1 基 因[30]，在 Wnt3a/betacatenin 信号通路的调控下，通过下调 Tbχ6 基因导致PSM 中 NOTCH 通 路 的 相 关 成 分 Dll1、Ripply2 和Mesp2表达降低，突变小鼠表现为与NOTCH 通路成分突变导致的体节形成异常一致[31]。Tbχ6 直接结合Mesp2 基因上游转录起始区域并调节 Notch 信号通路 和 其后 Mesp2 在前体 节中胚 层前 部 的转 录[32]，而Mesp2 突 变引起 脊 柱畸形 早 有报道。 Whittock 等[33]对一个 SCD 家系两个患者该基因测序后发现其Mesp2 存在 4 bp 的 重 复突变，随后 Cornier等[34]在 12个STD家系中发现10名患者存在Mesp2纯和无义突变，3名患者存在杂合无义突变或错义突变。Tbχ6在Wnt3a 的调节下直接激活 Ripply2 在 PSM 头侧的转录，在动物实验中证实 Ripply2 突变可以引起中轴骨的分节障碍[35]。在斑马鱼的发育过程中，Tbχ6 的同源基因 tbχ24 在 PSM 通过直接结合 mespb 启动子激活其表达，mespb 是 Mesp2的同源基因，在体节边界形成中发挥后者类似作用。在头侧，Ripply1 通过改变 tbχ24 功能，并与后者一起抑制 mespb 表达，以实现头尾分化[36]。

3 TBX6基因突变与先天性椎体畸形

关于TBX6基因可能引起脊柱发育畸形的临床报道可以追溯到 Hernando 等[37]对一个合并有多发畸形新生儿的病例报告，该患儿出生后表现出半椎体（L1）、足内翻、法洛四联症、肺动脉闭锁、单侧肾发育不全（右肾）、隐睾、单侧视网膜（右眼）和腭发育不良，最终于5个月时死亡。对其基因组进行比较基因组 杂 交 检 测（comparative genome hybridization, CGH），结果显示 16p11.2 位置存在 5～20 Mb 的缺失，限于当时研究水平，作者并未给出缺失区域和TBX6基因的位置关系和CVM可能的突变原因进行分析，但给后续研究提供了参考，接下来的4篇临床报道证实了具有16p11.2突变的CVM可能与TBX6相关。

Shimojima 等[38]报道了 16p11.2 位置片段缺失的一 个 自 闭 症 谱 系 障 碍（autism spectrum disorders, ASD）患者，患者为3周岁日裔男孩，除ASD外还伴有发育延迟，多发半椎体（T10，T12和L3），右侧第12肋缺失，左侧第12肋发育不全，腹股沟疝和睾丸鞘膜积液。利用aCGH对患者基因组进行了检测，发现患儿 16p11.2 位置上存在 593 kb 的缺失，虽然 16p11.2 突变和 ASD 相关性已有较多报道[39]，但大部分不伴有SCD。对该区域涉及基因进行分析，仅有TBX6基因与脊柱发育相关，且该缺失位置完全覆盖TBX6基因所在区域。进一步通过荧光原位杂交对缺失区域进行验证，并对父母染色体进行比对，发现其母亲具有相同缺失，但文章却未能提供其母亲脊柱的表型，因而无法判断患儿CVM是否是从母方遗传。对另一条16号染色体TBX6基因编码测序未发现突变，这与Ghebranious 等[40]的研究结果一致，他们对 50 例骶骨发育不全、Klippel-Feil综合征和多发颈椎、胸椎畸形患者的TBX6编码序列进行测序也未发现任何TBX6突变。TBX6引起CVM致病的原因尚不清楚。

Fei等[41]采用候选基因关联分析的研究策略，对比 127 例 汉族先 天性脊 柱侧凸（congenital scoliosis，CS）患者和127例匹配了年龄与性别的正常汉族对照的 TBX6 基因两个单核苷酸多态性（single-nucleotide polymorphisms， SNPs） ， 结 果 显 示 在 SNP1（rs2289292）位 点 含 有 A 等 位 基 因 和 SNP2 位 点（rs3809624）含有 G 等位基因者具有更高的CS 易感性（P 值分别为 0.017 和 0.033），SNP1G-SNP2A 对于避免 CS 的发生具有保护作用（P=0.045）。Shen 等[42]报道了一个 16p11.2 缺失的中国 ASD 家系，先证者为12岁男孩，表现有ASD合并精神发育迟滞，房间隔缺损，脊柱侧凸伴有多发半椎体（T7和L3），肢端肥大和贯通掌等身体畸形。通过对先证者本人、弟弟、父母和祖父母6人基因组进行aCGH检测，发现先证者、其弟弟和其父亲均存在 16p11.2 位置 606 kb 的缺失，该突变为在其父亲的新发突变，但在表型方面，先证者弟弟和父亲除具有不同程度的自闭缺陷和社会化障碍外，并不具有脊柱和心脏等畸形。对该区域候选基因进行分析，提示该缺失区域完全覆盖了TBX6基因，进一步对编码链TBX6的测序并未发现任何致病性突变，通过比对先证者和其弟弟编码链TBX6的SNP，发现二人该染色体来自母方不同16号染色体，且先证者 rs228 9292（A/G）位 SNP 为 A，而其弟弟和父 亲 表现为 G，这 与 Fei等[41]先 前的结 论 较为一 致 。最近，Sparrow 等[13]报道了一个 3 代中 4 例 SCD 患者的马其顿家系，患者为先证者、其父亲、伯父和祖父，遗传模式为常染色体显性遗传，临床表现为半椎体形成和椎体融合引起的脊柱侧凸和身材矮小，除每代均有SCD患者外，Ⅱ代还有6个婴儿不明原因死亡。通过对该家系部分成员进行全外显子测序后，选择与椎体发育相关的基因，进行患者与非患者特异性比对，发现患者均存在 TBX6（c.1311A＞T）的杂合突变，该突变为终止缺失突变，而非患者均为野生型，因此推测TBX6单倍剂量不足可能为SCD致病原因。先前研究证实，Tbχ6 直接结合 Mesp2 基因上游转录起始区域并调节 Notch 信号通路和其后 Mesp2在前体节中胚层前部的转录。作者进一步通过插入荧 光 素 验 证 基 因 的 Mesp2 基 因 来 对 比 TBX6 与TBX6stoploss的 功 能 ，结 果 显 示 TBX6stoploss和 TBX6 对Mesp2 转录活性具有显著差异（P＜0.001），将 TBX6与 TBX6stoploss分别转染到 C2C12 小鼠肌细胞中，通过western blot来对比两者表达的量，结果提示该突变并不影响TBX6的转录水平，但突变后的TBX6表达产物C末端增加了84个无义氨基酸，突变型活性降低可能与其相关。作者在小鼠模型上也进行了验证，通过对比 Tbχ6 缺失型（Tbχ6tmPa1）杂合子和野生型的表型，发现56只杂合子中26只表现为颈椎缺陷，17只表现为骶椎缺陷，属不完全外显，其外显率为43/56。

4 展望

CVM 是一种多基因遗传病。Tbχ6/tbχ24 在小鼠和斑马鱼体节发育中的研究提示TBX6在轴向干细胞向PSM分化和体节形成中起重要作用。该基因改变可能会引起CVM，其致病原因可能为单倍剂量不足。临床上也有越来越多的CVM被报道可能由于TBX6突变所导致，致病机制和动物模型非常类似。但目前，临床上关于TBX6引起CVM主要集中于病例报道，大样本病例验证尚不多见，TBX6突变与CVM临床表型间的关系文献报道较少。此外，在以往的报道中，TBX6（Tbχ6）基因杂合缺失的个体并非都表现CVM，而是具有一定的外显率，其确切的机制还有待进一步研究。

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国家自然科学基金资助项目（项目编号：81130034、81271942）；北京市青年基金项目（项目编号：7144235）；北京协和医学院大学生创新训练计划（项目编号：2013zlgc0629）

**通信作者：吴志宏，E-mail：orthoscience@126.com