氨氮对虾类毒性影响的研究进展

■冼健安 钱 坤 郭 慧 苗玉涛 王安利 王冬梅

（1.中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海南海口571101；2.华南师范大学生命科学学院广东省水产健康安全养殖重点实验室生态与环境科学广东普通高校重点实验室，广东广州510631）

1 水体氨氮的来源和存在形式

在养殖水体中，氨氮主要有两个来源：一是养殖水产动物蛋白质代谢产物的排泄；二是粪便和残饵这些含氮有机物的氨化作用。因物种而异，甲壳动物的氮废物有40%～90%以氨氮的形式从鳃上皮组织排出体外，另外的氮排泄物还有少量氨基酸、尿素、尿酸和氧化三甲胺等。

2 氨氮对虾类的半致死浓度（median lethal concen⁃tration，LC50）

2.1 氨氮对不同虾种虾的半致死浓度

总氨氮和非离子氨氮对不同虾类的24 h LC50见表1。由于氨氮毒性容易受多种环境因子影响，各研究的实验条件存在一定差异，所以难以准确比较不同虾类的氨氮耐受性。粗略比较归纳目前的研究结果，就幼虾而言，脊尾白虾（Exopalaemon carinicauda）和克氏原螯虾（Procambarus clarkii）的氨氮耐受性较高，其24 h LC50可达150 mg/l以上，其它虾类则在10～70 mg/l之间。

表1 氨氮对不同虾类的24 h半致死浓度（24 h LC50）（mg/l）

2.2 氨氮对不同虾龄虾的半致死浓度

对斑节对虾（Penaeus monodon）的研究结果显示，随着幼体时期的增长，氨氮的耐受力也逐渐增强，即耐受力依次为：后期幼体＞糠虾＞溞状幼体＞无节幼体。凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）的研究显示，溞状幼体和糠虾的耐受力接近，且高于仔虾。在日本囊对虾（Marsupenaeus japonicus）的研究中，姚庆祯等的研究认为，24 h氨氮耐受力：仔虾＞糠虾＞溞状幼体，李建等同时研究了无节幼体，结果显示：仔虾＞糠虾＞无节幼体＞溞状幼体。对不同虾龄的成体虾进行比较研究发现，脊尾白虾（E.carinicauda）和克氏原螯虾（P.clarkii）随着虾龄的增长，氨氮耐受力增强，其它虾类还有待研究。

2.3 影响氨氮毒性的环境因素

如前所述，水体pH值、温度和盐度均会影响非离子氨占总氨的比例，从而影响氨氮对水产动物的毒性。盐度越高，虾类表现出越高的氨氮耐受力，较高的盐度除了减少非离子氨比例外，还有两个过程会降低氨氮的毒性：一方面，Na+很容易置换鳃膜上的，从而促进内生氨的排泄；另一方面，Ca2+和其它二价阳离子通过增强鳃膜渗透性或增加Na+富集来减少氨的毒性。溶氧越高，虾类的氨氮耐受力也越强，这是由于溶解氧含量高使虾体呼吸频率下降，进入虾体的氨含量减少；另一方面，溶解氧含量高使虾体载氧能力和NH3的代谢能力也随之加强，从而降低了氨的毒性效应。

3 氨氮在虾体内的积累

氨等代谢物质通过血淋巴运输而排出体外，血淋巴中氨含量的变化可以在一定程度上反映机体的代谢状态。另外，环境中的氨通过鳃上皮细胞后，也进入血淋巴被运输至其它部位。日本囊对虾（P.ja⁃ponicus）的研究发现，不经处理的对虾的血氨含量在2.58～3.35 mg/l之间，当暴露于10 mg/l的氨氮时，对虾血氨含量在2 h后显著上升，在16 h后达到了11.33 mg/l；暴露于100 mg/l的氨氮12 h后，血氨含量达到20.53 mg/l，对虾在14 h后全部死亡。中国明对虾（F.chinensis）的研究也显示，氨氮胁迫下，血氨含量总体呈现上升的趋势。日本囊对虾（P.japonicus）暴露于不同pH值（6.3、7.2、8.2和9.0）的100 mg/l氨氮水体中，pH值9.0组对虾的血氨含量在10 min后已显著高于其它pH值组的对虾，并且在胁迫的30～60 min内死亡；其它pH值组对虾的血氨含量随着胁迫时间延长而上升，在实验的14 h内无死亡现象。水体pH值的提高，使非离子氨的比例升高，此时进入机体的氨含量迅速提高，并且导致氨的毒性大大加强。笔者还认为，在高pH值条件下氨氮毒性的增强如此迅速，是由于当非离子氨进入虾体血淋巴后，环境中的离子氨和非离子氨的平衡被打破，离子氨持续向非离子氨转变，非离子氨也持续进入虾体。

氨氮不仅在血淋巴中积累，在其它组织中也有积累的情况。斑节对虾（P.monodon）暴露于0.718 mM氨氮24 h后，与对照组相比，其血淋巴、鳃、肝胰腺和肌肉中的氨氮水平分别提高了160%、105%、236%和68%。可见，氨氮在肝胰腺中的积累比血淋巴更为严重，可能是由于肝胰腺发挥着解毒的作用。

4 氨氮对虾类的毒性影响

4.1 对虾类生长和变态的影响

研究显示，一定含量的氨氮会显著抑制虾类幼体的变态和生长。随着氨氮质量浓度的升高，除无节幼体外，日本囊对虾（P.japonicus）各期幼体（溞状幼体、糠虾幼体和仔虾）的存活率和未变态个体的日生长率均逐渐降低，但变态率和变态个体的日生长率则逐渐升高。笔者认为一定浓度的氨氮会抑制各期幼体的生长，并因毒性的累积而导致其死亡，而提高了变态率可能是氨氮影响了对虾的内分泌调控（x-器官分泌合成的蜕皮抑制激素和y-器官分泌合成的蜕皮激素相互作用的调控）。而脊尾白虾（E.carinicauda）糠虾幼体经亚急性氨氮胁迫后，变态率显著降低；随着胁迫时间的延长，糠虾幼体的变态率提高，但肌肉组织细胞的RNA/DNA比值则逐渐下降，表明虽然糠虾幼体的变态个体在增加，但虾体自身的生长代谢过程仍受到了氨氮的抑制。在罗氏沼虾（M.rosenber⁃gii）幼体发育期间，水体中的非离子氨含量超过0.11 mg/l 6 d时，幼体变态时间延长、存活率降低。对虾（P.penicillatus）暴露于 10 mg/l和 15 mg/l的氨氮28 d后，体重和体长的增长显著下降；56 d生长半抑制浓度(56 d EC50)为总氨氮12.65 mg/l，非离子氨 0.76 mg/l。暴露于 4、8 mg/l和 20 mg/l氨氮水体中30 d的斑节对虾（P.monodon）幼虾的蜕皮频率加快，但生长性能显著低于对照组对虾。粉红对虾（Farfantepenaeus paulensis）暴露于高浓度氨氮75 d，对虾的摄食量会下降，以限制体内氮废物的产生和积累，对虾的能量代谢过程会发生改变，虾体的脂肪含量下降，而糖类含量上升，生长性能显著下降。

4.2 对虾类组织结构的影响

氨氮在血淋巴中积累，血细胞必将首先受到胁迫毒害作用。研究显示，氨氮胁迫导致罗氏沼虾（M.rosenbergii）血细胞总数（total haemocyte count,THC）下降，血细胞的超微结构发生改变，主要表现核膜内陷变形，线粒体、粗面内质网、胞质高电子致密颗粒数量明显减少，有些颗粒细胞的酶原颗粒和内质网等以囊泡形式脱离细胞，细胞质大量流失。氨氮对血细胞超微结构的影响将导致血细胞各种生理和免疫功能的破坏。

鳃和肝胰腺也是受氨氮毒性损害的主要部位。红螯螯虾（Cherax quadricarinatus）经中、高浓度氨氮胁迫后，鳃角质层受损；上皮细胞溶解；鳃腔内出现空泡化现象。高浓度氨氮造成肝小管出现溶解现象，管间趾增大明显；微绒毛受损严重，排列极其不规则，甚至断裂；上皮细胞大都裂解，空泡化严重；肝小管间的结缔组织变得稀薄，血细胞变形或裂解；R细胞脂滴增多，细胞核变形；F细胞出现内质网减少、空泡化、线粒体变形的现象。中国明对虾（F.chinensis）经 10.44 mg/l和 11.44 mg/l胁迫7.5 d后，其肝胰腺内部分肝管壁的吸收细胞已完全转化为分泌细胞，这些肝小管管壁全由分泌细胞构成；另有一部分肝小管细胞已完全解体；15 d后，肝胰腺结构受到更大的损伤和破坏，受损肝管约占1/3～1/2。

4.3 对虾类生理代谢的影响

鱼类和甲壳动物的氨排泄路径有三条：①以NH3的形式从血液向水体中扩散；②与Na+的交换；③转化为尿素等毒性较小的物质。

在水体高浓度氨氮的作用下，鳃Na+,K+-ATPase活性下降，虾体内的积累，Na+的吸收过程受到了抑制，从而导致血淋巴渗透压的下降。此时，为了维持血清渗透压的平衡，虾体的氮分解代谢过程发生了相应的改变，血清蛋白被分解为尿素和游离氨基酸（free amino acid,FAA），因此在氨氮胁迫时，血清总蛋白和血蓝蛋白含量会显著下降，同时伴随着血清尿素和FAA含量显著上升。Chen等（1994）的研究发现，经氨氮胁迫后，斑节对虾（P.monodon）血清中牛磺酸含量显著提高，认为牛磺酸是起到渗透压调节作用的主要FAA类型。另外的研究发现，斑节对虾（P.monodon）经0.718 mM氨氮胁迫24 h后，血淋巴总FAA含量上升，在肝胰腺中总FAA含量下降，而在鳃和肌肉中则没有显著的变化。在胁迫组对虾的肝胰腺中，尿素和鸟氨酸含量分别上升了107%和1 446%，而精氨酸则下降了50%，尿素和鸟氨酸含量的上升伴随着精氨酸和其它FAA含量的下降，表明在肝胰腺中FAA被分解，并生成了尿素。

由于血氨的积累以及氮分解代谢过程的改变，导致氮排泄的模式也发生了改变。在10‰的盐度下，斑节对虾的排泄氮组成为：氨氮78.13%、亚硝酸氮10.34%、硝酸氮6.41%、尿素氮0.72%、可溶性有机氮4.40%；当斑节对虾经20 mg/l氨氮胁迫24 h后，排泄氮组成变为：亚硝酸氮2.21%、硝酸氮0.49%、尿素氮11.15%、可溶性有机氮86.15%。亚硝酸氮和硝酸氮所占比例有所下降，但从排泄量上而言，仍与尿素氮和可溶性有机氮一样，高于对照组。可溶性有机氮主要是游离氨基酸，其排泄量的升高幅度最大，成为了此时氮排泄的主要形式。氨氮向其它形式的氮的转变，有利于氮废物的排泄，降低血氨的毒性。这些发现同时也表明，在氨氮胁迫作用下，虾类对蛋白质利用效率大大下降，水体有机物污染加重，导致虾类的正常生长受到抑制。

4.4 对虾类免疫功能和抗氧化活力的影响

血细胞在虾类的免疫过程中起着至关重要的作用，包括吞噬、包裹、细胞毒活性、储存与释放酚氧化酶原系统等。正常状态下，虾类的血细胞数量保持在一定的范围，而在患病或胁迫状态下，常表现出THC的下降。因此THC是反映虾体免疫功能状态的一个重要指标。较多研究显示，在氨氮胁迫状态下，虾类的THC会呈现显著的下降。中国明对虾（F.chinensis）经不同浓度的氨氮胁迫后，其血细胞中与凋亡相关的酶Caspase的表达量不同程度地被诱导上调，推测氨氮胁迫通过诱导Caspase的表达从而诱导血细胞发生凋亡。氨氮引起的血细胞超微结构的变化可能是血细胞发生凋亡的表现。这些结果初步解释了氨氮导致虾类THC下降的原因。也有少量研究显示，经氨氮胁迫后，凡纳滨对虾（L.vannamei）和罗氏沼虾（M.rosenbergii）的THC、以及透明细胞和颗粒细胞数量均没有显著变化，作者对此结果没有进行进一步的分析和推测。但比较可发现，这两个研究的取样时间点过少，凡纳滨对虾的研究只在胁迫的第2 d和第7 d取样，THC发生显著变化的过程很有可能没有表现出来；而罗氏沼虾的研究更是仅在胁迫的第7 d取样，氨氮浓度也相对较低(0.55～3.18 mg/l)。在这两个研究中，尽管THC在实验条件下没有呈现显著变化，但血细胞的吞噬活力和清除效率还是表现出了显著的下降；另外一些研究也报道了氨氮胁迫导致虾类血细胞吞噬活力下降，这些结果表明氨氮胁迫对血细胞的免疫功能起到抑制作用，这是氨氮导致虾类对病原体易感性提高的重要原因之一。

酚氧化酶（PO）是重要的免疫酶类，它以酶原的形式（酚氧化酶原proPO）储存在小颗粒细胞和大颗粒细胞的颗粒中，经诱导后通过胞吐作用释放到胞外并被激活为活性的PO。在氨氮胁迫下，PO的活力表现出一定的波动性。细角滨对虾(L.stylirostris)的研究发现，经3.0 mg/l氨氮胁迫后，PO活力提高，但proPO和黏附蛋白(peroxinectin)的mRNA表达量下降。姜令绪等（2004）的研究显示，凡纳滨对虾（L.vannamei）经氨氮胁迫（0.5～2.5 mg/l）的48 h内，PO活力呈逐渐上升的趋势。邱德全等（2008）研究发现，凡纳滨对虾（L.vannamei）经0.75 mg/l氨氮胁迫3 d和7 d后，PO活力增强，而胁迫14 d后，PO活力反而下降；当氨氮浓度为3.00 mg/l，PO活力一直呈现下降趋势。Liu等（2004）的研究则显示凡纳滨对虾（L.vannamei）经氨氮胁迫2 d时，PO活力没有显著变化；而高浓度（5.24、11.10 mg/l和21.60 mg/l）胁迫7 d时，PO活力显著下降。罗氏沼虾（M.rosenbergii）经氨氮（0.55、1.68 mg/l和3.18 mg/l）胁迫7 d后，PO活力显著下降。中国明对虾（F.chinensis）在2.5 mg/l氨氮水体中暴露20 d后，与对照组相比，PO活力下降19.1%。PO活力对氨氮胁迫的响应较为复杂，以往的研究没有得出较一致的结果，但不难看出，其活力的变化与氨氮浓度和胁迫时间有密切的联系，具体影响规律仍有待进一步研究。

其它免疫相关酶和抗氧化酶的活力也会不同程度地受到氨氮的影响。红螯螯虾（C.quadricari⁃natus）幼虾经16 mg/l氨氮胁迫3 d后，肌肉酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）和超氧化物歧化酶（SOD）活性分别下降至对照组的76%、68%和62%，线粒体 Mn-SOD和胞外Cu、Zn-SOD的mRNA表达量分别下降至对照组的69%和68%；而过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）活性以及GPx、谷胱甘肽转移酶（GST）的表达量没有显著变化。中国明对虾（F.chinensis）在2.5 mg/l氨氮水体中暴露20 d后，与对照组相比，SOD、过氧化物酶（POD）、溶菌活力和抗菌活力分别下降15.1%、21.4%、12.5%和36.6%，并且注射副溶血弧菌后死亡率明显高于对照组。另外的研究发现，当水体氨氮浓度为0.303～8.625 mg/l时，中国明对虾（F.chinensis）总抗氧化活力（T-AOC）、抗超氧阴离子活力及CAT基因表达水平升高，并在胁迫后6 h和96 h达最高值；过氧化物还原酶基因表达水平在72～96 h达最高值；当氨氮浓度大于8.625 mg/l时，其抗氧化系统受到抑制。罗氏沼虾（M.rosenbergii）经1 mg/l非离子氨态氮胁迫10 d，血清、肝胰腺和肌肉中的SOD活力基本表现为先上升后下降；各组织的ACP和AKP则有不同程度的上升。凡纳滨对虾（L.vannamei）经20 mg/l氨氮胁迫72 h后，肝胰腺SOD、CAT和GPx以及血清SOD活力显著下降，血清GPx活力上升，肝胰腺和血清的脂质过氧化程度显著上升。由于各研究的实验条件和物种的差异，得到的结果也存在一定的差异。总体而言，氨氮胁迫会抑制虾类部分免疫相关酶活力，降低血细胞的免疫活性，从而导致虾体对病原体的易感性提高，增加病害爆发的可能性；另一方面，氨氮胁迫诱导机体内活性氧（ROS）的产生是其影响抗氧化酶活力的原因，胁迫前期或胁迫程度较低时，抗氧化酶会被诱导以清除过量的ROS，而胁迫程度严重时，抗氧化酶的活力反而受到抑制。ROS对虾体造成氧化损伤被认为是氨氮对虾体产生毒性的主要机制之一。

5 展望

目前的研究已显示，虾类的存活、生长发育、生理代谢和免疫功能等均会受到水体氨氮的毒性影响。但是，氨氮毒性的具体作用机制仍有待深入研究，氨氮仍然是危害水产养殖健康发展的重要环境因素之一。今后可从以下几个方面开展进一步的研究：①利用转录组、蛋白组等技术研究氨氮毒性的分子机制；②从营养生理代谢的角度，更多地关注不同饲料配方对虾类蛋白质利用率和氨氮排泄量的影响；③从营养免疫学的角度，研究饲料营养素和添加剂对虾类抗氨氮胁迫能力的影响。