不同发酵条件对植物乳杆菌生长的影响

2014-01-21王兰惠梁海威甄玉国

饲料工业 2014年22期

■ 赵巍付丽王欣王兰惠梁海威甄玉国，2

（1.吉林农业大学吉农博瑞奶牛研发中心，吉林长春130118；2.长春博瑞饲料集团有限公司技术中心，吉林长春130114）

乳酸菌(Lactic Acid Bacteria,LAB)是人体的益生菌,具有调节人体胃肠道正常菌群、保持微生态平衡,提高食物消化率和生物价,降低血清胆固醇,抑制肠道内腐败菌的生长繁殖和腐败产物的产生等作用[1-3]，在医药、食品等工业有广泛的应用[4]。植物乳杆菌是一类化能厌氧型乳酸菌[5],不同的发酵工艺对其生长有不同的影响。对于一个工业生产菌株，为了充分发挥菌种的生产能力实现高产，不仅需要拥有一个良好的发酵培养基，还需要对发酵条件进行优化。本试验对植物乳杆菌的培养方式、发酵温度、培养基初始pH值、接种量进行了研究，旨在获得植物乳杆菌的最佳发酵条件，提高菌体生物量。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种来源

植物乳杆菌：由中国微生物菌种保藏中心提供。

1.1.2 培养基

种子培养基[6]：蛋白胨10.0 g、牛肉膏10.0 g、酵母粉5.0 g、葡萄糖5.0 g、吐温80 1.0 ml、柠檬酸氢二铵2.0 g、无水乙酸钠 5.0 g、K2HPO42.0 g、MnSO4·H2O 0.05 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、蒸馏水 1.0 L，pH值6.80，121℃高温灭菌20 min。

发酵培养基：蛋白胨30.0 g、葡萄糖30.0 g、无水乙酸钠 15.0 g、柠檬酸氢二铵 5.0 g、吐温 80 4.0 ml、K2HPO42.0 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、MnSO4·H2O 0.05 g、蒸馏水1.0 L,pH值6.80，121℃高温灭菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 试验设计

采用单因素试验设计，筛选植物乳杆菌生长的培养方式、最佳初始pH值、最适培养温度和最适接种量，然后进行正交试验。

1.2.2 乳酸菌生长曲线绘制

取斜面菌种一环，接入MRS液体培养基中，37℃培养24 h，活化两代。将活化后的乳酸菌，接入400 ml MRS液体培养基中，接种量为2%。将接入菌体的液体培养基摇匀后分装于10 ml EP管中，每管5 ml，置于37℃的培养箱中静置培养。每隔2 h取3支EP管置4℃冰箱保存。待EP管全部取完后，用722型分光光度计在光程为1 cm，波长为600 nm测量吸光度值，以同一批次灭菌而未接入菌种的MRS液体培养基为参比，绘制菌体生长曲线。

1.2.3 培养方式对植物乳杆菌生长的影响

选用优化后的发酵培养基，按2%的接种量以厌氧、有氧和静止的方式分别在厌氧培养箱、恒温振荡水浴锅和恒温培养箱中培养16 h，培养温度为37℃，每种培养方式5个重复，测定OD取平均值。

1.2.4 培养基初始pH值对植物乳杆菌生长的影响

采用单因素试验，将发酵培养基的初始pH值用1 mol/l的盐酸和1 mol/l氢氧化钠分别调整为4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，按照2%的接种量接种于三角瓶中，每个处理5个重复，37℃厌氧培养16 h后，在600 nm条件下测定OD值取平均值，确定最佳pH值。

1.2.5 培养温度对植物乳杆菌生长的影响

以发酵培养基为基础培养基，通过单因素试验，将培养温度分别设定为30、37℃和42℃，按照2%的接种量，在厌氧培养箱培养24 h，每隔2 h取一次样，在600 nm下测定OD值，绘制不同温度各时间点的植物乳杆菌的生长状况曲线，确定最适培养温度。

1.2.6 接种量对植物乳杆菌生长的影响

以发酵培养基为基础培养基，通过单因素试验，分别以2%、4%、6%、8%、10%、15%的接种量接种于发酵培养基中，培养基的初始pH值为6.0，37℃厌氧培养24 h，每隔2 h取一次样，在600 nm条件下测定OD值，绘制出不同接种量对植物乳杆菌生长状况的曲线，确定最适接种量。

1.2.7 菌液OD值的测定

取发酵后的培养液摇匀，取0.5 ml稀释20倍后，用722型分光光度计在600 nm条件下测定OD值。

1.2.8 正交试验

在单因素筛选的基础上得到最佳的培养基初始pH值、培养温度和接种量，考虑到各因素之间的互作效应，采用正交试验设计，培养16 h后测定OD值确定各培养条件的最优组合。

1.3 统计分析

用Excel将不同培养基成分对植物乳杆菌OD值和pH值的影响进行整理，通过SPSS 17.0进行差异显著性分析。

2 结果

2.1 植物乳杆菌的生长曲线（见图1）

通过生长曲线我们可以看出，随着培养时间的增加，植物乳杆菌的生物量在迅速增长，在4 h进入对数期，到达16 h进入稳定期，24 h以后OD值略有下降，可能是由于一部分细菌发生菌体自溶。pH值的变化和植物乳杆菌的生物量变化是相符合的，由于植物乳杆菌发酵过程中产生乳酸，所以，随着培养时间的增加，pH值急剧下降，当培养到16 h，pH值下降幅度减小，逐渐趋于稳定，因为发酵产物中积累了大量的乳酸，抑制了乳酸菌的繁殖，所以pH值的下降幅度会减小。

图1 植物乳杆菌的生长曲线和pH值变化曲线

2.2 培养方式对植物乳杆菌生长的影响（见图2）

图2 培养方式对植物乳杆菌生长的影响

乳酸菌依据对氧的需求分为好氧型、专性厌氧型和兼性厌氧型。植物乳杆菌为兼性厌氧菌，溶氧是进行能量代谢最重要的气相底物，并且通常是发酵的限制性因素。培养基的供氧情况影响氧化还原电位值，不同的氧化还原电位值可能使嗜酸乳杆菌的代谢途径发生改变，从而影响菌体的生长[7]。

从图2中可以看出，采用摇瓶培养植物乳杆菌的OD值最小，而采用厌氧培养和静置培养植物乳杆菌的OD值显著高于摇瓶培养（P＜0.05）。由图2可知，采用摇瓶培养，在培养的过程中，培养基中溶氧相对比较大，对植物乳杆菌的生长不利。因此，植物乳杆菌用厌氧方式培养更好。

2.3 培养基初始pH值对植物乳杆菌生长的影响(见图3)

每种微生物都有一个适宜的pH值范围，而微生物细胞对pH值的改变是很敏感的，环境中的氢离子浓度如果超过了微生物的适应范围，就会降低抑制这些微生物的生命活动[8]。图3为不同初始pH值对植物乳杆菌生长的影响，由图3可知，随着pH值的增加，植物乳杆菌的OD值逐渐增加，当pH值达到6.0时，OD值达到最大，继续增大pH值，OD值降低，这说明pH值过高或过低对植物乳杆菌的增殖都存在不利的影响。pH值的变化会引起植物乳杆菌体内酶发生变化，从而影响细菌的生长。

图3 培养基初始pH值对植物乳杆菌生长的影响

2.4 培养温度对植物乳杆菌生长的动态曲线(见图4)

图4 培养温度对植物乳杆菌生长的动态曲线

培养温度与微生物的生长密切相关，微生物生长是一系列复杂化学反应的结果，而温度的改变必然影响生物体内所进行的许多生化反应，进而影响它们的生长速率。通常，在生物学范围内每升高10℃，生长速度就加快一倍，当超过最适生长温度，生长速率随温度升高而下降[9]。因此，研究培养温度对植物乳杆菌的生长至关重要。

图4为植物乳杆菌在不同温度下不同时间点OD值的动态变化过程。图4表明，在一定范围内，温度过高或过低使植物乳杆菌进入稳定期的时间会延迟，而最终达到的生物量基本相同。采用37℃培养植物乳杆菌在16 h进入稳定期，OD值达到最大，而采用30℃和42℃达到稳定期的时间相对滞后4 h，考虑到工业化生产的生产效率，37℃为植物乳杆菌最适培养温度。

2.5 接种量对植物乳杆菌生长的动态曲线（见图5）

图5 接种量对植物乳杆菌生长的动态曲线

由图5可以看出，不同的接种量对菌体生长的影响不同，接种量大，菌体生长繁殖快，但是后期由于营养缺乏，菌体衰退的也很快；接种量小，菌体前期生长慢，达到稳定期的时间相对滞后一点，但是后期菌体生长良好。15%的接种量，菌体繁殖最快，但是后期菌体衰退的最为严重；2%的接种量，虽然前期生长的缓慢，但是最终达到稳定期的时间及所能达到的最大生物量基本和15%一样，而且菌体后期生长的仍然很好。综合各方面因素，植物乳杆菌的最佳接种量为2%。

2.6 正交试验

正交试验因素水平设计见表1，正交试验结果见表2。

表1 正交试验设计

表2 发酵条件正交试验

由正交试验结果可知，从R值可以看出，影响植物乳杆菌OD值的主次顺序为A＞B＞C,因此，植物乳杆菌发酵条件的最优培养基组合为A3B2C2，即培养基的初始pH值为6.5、温度为37℃、接种量为2%。从R值可以看出，培养基的初始pH值对于OD值影响最大，综合考虑发酵条件的互作效应，植物乳杆菌发酵条件的最优组合为A3B2C2。在此条件下进行验证试验，植物乳杆菌的OD值为18.628。

3 讨论

培养基的初始pH值、培养温度、接种量及培养方式都是影响微生物生长的重要因素，每种微生物都有各自的最佳培养方式、最适接种量、最适培养温度和最佳pH值，不当的培养条件，会抑制植物乳杆菌的生长甚至导致死亡。培养温度和接种量对植物乳杆菌生长的影响在不同的时间点影响不同，所以只有实时监测不同的时间点，绘制曲线才能发现培养温度和接种量对植物乳杆菌的动态变化过程。

李雅乾等[10]研究表明，温度是影响菌株发酵的重要因素之一。闫征等[11]认为，H+和乳酸的积累是抑制乳酸菌生长的直接原因。张兰威等[8]的研究表明，温度影响混合生长的菌株的比例，而较高温度有利于这种比例达到平衡。J.Mufandaedza等[12]也针对温度对多种乳酸菌混合培养的影响进行了研究，并取得了一定成效。马静等[13]认为，温度是影响乳酸菌胞外多糖产量的因素之一，并且并不是在最适温度时产量最高，这还与各菌株的特性有关。Gassem等[14]认为，较低的接种温度导致活菌数量缓慢增加，有利于延长乳酸菌的对数期和稳定期，从而提高如胞外多糖等次级代谢产物的产量。闫征等[11]研究了pH值对乳酸菌生长和乳酸产量的影响，研究结果表明，pH值控制在6.0左右时，乳酸产量最高。pH值为6.5时乳酸菌生长最好，可能主要是由于试验菌株不同。闫智慧等[15]的研究认为，菌株生长和产酸的较适pH值为6.5。陈超[16]的研究表明，pH值为5.6条件下，相对酶活性达到最高。侯爱香等[17]认为，培养基的起始pH值以及在培养过程中对pH值的控制都会影响乳酸菌胞外多糖的最终产量。张兰威等[8]的研究表明，pH值不仅影响单个菌株的生长，而且影响混合生长的菌株间的比例。马静等[13]认为，pH值是影响乳酸菌胞外多糖产量的因素之一，培养液起始pH值及在培养过程中对pH值的控制都会影响胞外多糖的最终产量。除此之外，种子液的种龄、培养的时间也对微生物的生长有一定的影响。测定生长曲线的意义在于分析菌体在种子培养基中生长的最佳阶段，并以此阶段的菌体作为接种待优化培养基的菌源。关秀艳等[5]研究指出，太年轻或过老的种子均对培养不利：太年轻的种子接种后往往会前期生长缓慢，整个培养周期延长；过老的种子虽然菌量较多，但接种后会导致生产能力下降，菌体过早衰退。本试验选取16 h的种子液接种。

本试验通过正交试验表明，培养基的初始pH值、培养温度和接种量对植物乳杆菌的生物量有不同程度的影响。最佳初始pH值为6.5，这一结果与闫征和闫智慧等的结果相一致。培养温度为37℃，温度过低和过高都会抑制菌体的繁殖。接种量为2%，接种量的高低直接影响发酵周期的长短，而且对后期植物乳杆菌的繁殖活力也有很大的影响。