秸秆纤维素降解真菌的筛选、鉴定及产酶条件的优化

2014-01-21韩愈杰吴国江

饲料工业 2014年11期

■韩愈杰魏萌吴国江

（河北农业大学生命科学学院，河北保定 071001）

我国作为农业大国，农作物秸秆资源十分丰富，约占农作物生物学产量的60%，但因秸秆中营养物质难以被利用而大部分被焚烧，仅有少量作为粗饲料用于反刍动物，这样不仅造成环境的污染，还造成秸秆资源严重浪费。因此，将丰富的秸秆资源转化为秸秆饲料等可利用资源，对畜牧业的发展、解决人类环境的污染和人畜争粮问题均具有重大意义。目前，秸秆饲料的加工工艺主要采用物理法或化学法，但无论哪种方法均不能保证秸秆饲料营养成分充分合理利用。微生物具有强大的产酶性能，可以将木质素、纤维素降解并转化为成糖、乙醇、饲料蛋白等，提高了秸秆饲料营养价值，一定程度上可以减少精料使用。

目前利用微生物转化秸秆为可利用的饲料资源，已成为国内外研究的热点。有研究表明，用于微生物转化的菌株多为真菌，主要有木霉、曲霉和青霉等。但因其产酶活力低，菌种单一等原因，制约了秸秆饲料广泛应用。因此筛选高产纤维素酶的菌株，扩大菌种来源，成为研究的一项重要任务。

本研究用刚果红羧甲基纤维素钠培养基法从富含腐烂落叶和秸秆的土壤中分离筛选到1株高纤维素酶活的真菌，测定其酶活力，并对产内切葡聚糖酶条件进行了初步研究。本试验为纤维素酶工业化生产提供了重要的依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品来源

样品来源于河北保定富含腐烂落叶和秸秆土样。

1.1.2 培养基配方

纤维素刚果红培养基：纤维素粉1.88 g，K2HPO40.50 g，MgSO40.25 g，刚果红 0.20 g，琼脂 14.00 g，明胶 2.00 g，土壤浸汁100 ml，pH 值7.0，定容到1 000 ml。

无碳基础培养基：KH2PO42 g，(NH4)2SO44 g，Mg-SO4·7H2O 0.5 g，蛋白胨 10 g，牛肉膏 5 g，定容到1 000 ml。

无氮基础培养基：CMC-Na 10 g，KH2PO41 g，Mg-SO4·7H2O 1 g，NaCl 5 g，定容到1 000 ml。

马铃薯葡萄糖培养基（PD）：马铃薯200 g（去皮，切成小块煮沸20 min，纱布过虑），葡萄糖20 g，定容到1 000 ml。

种子培养基：去皮马铃薯200 g，切碎煮沸30 min过滤，葡萄糖20 g，定容到1 000 ml。

发酵产酶培养基：CMC-Na 10 g，(NH4)2SO44 g，KH2PO42 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，定容到1 000 ml，pH值自然。

玉米秸秆培养基：玉米秸秆粉3 g，蒸馏水100 ml（固体培养则不加水），pH值自然。

1.2 方法

1.2.1 菌株的筛选

将采集的腐木和土样进行富集培养、平板分离和摇瓶发酵复筛，将产酶能力较高菌株挑选出来供进一步试验。

1.2.2 粗酶液的制备

把100 ml发酵产酶培养基装入250 ml三角瓶中，从种子培养基中取2 ml菌悬液接种到发酵产酶培养基中，30 ℃、180 r/min摇床振荡培养3 d，4℃、6 000 r/min离心15 min，取上清液，即为粗酶液。

1.2.3 酶活力测定方法

①采用羧甲基纤维素酶活力的方法测定羧甲基纤维素酶(CMC)活，滤纸酶活力的方法测定滤纸酶(FP)酶活。

② 内切纤维素酶（EG）的测定：取粗酶液0.5 ml，加入含1%CMC-Na的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH值4.8，0.1 mol/l)2 ml，经 50 ℃恒温水浴 30 min 后，立即用DNS法测定还原糖。

③ 外切纤维素酶(CBH)的测定：取粗酶液0.5 ml，加入含2%Avicel的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH值4.8，0.1 mol/l)2 ml，50 ℃恒温水浴2 h，立即按DNS法测定还原糖。

④ β-葡萄糖苷酶(BG)的测定：取粗酶液0.5 ml,加入含0.5%水杨苷的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH值4.8，0.1 mol/l)2 ml，50 ℃恒温水浴30 min，立即按DNS法测定还原糖。

1.3 菌株的鉴定

1.3.1 形态学鉴定

根据《中国真菌志》测定方法，采用载片培养法培养真菌，光学显微镜下观察菌丝体大小、形状、表面特征及是否有横隔、孢子大小、形状、类型等，对照确定菌株的种属地位。

1.3.2 分子生物学鉴定

参照真菌总DNA的提取方法，提取菌株的DNA。以提取的DNA为模板，用通用引物扩增ITS序列，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。回收并与pMD18-T连接,16℃连接过夜。转化后挑阳性克隆提质粒，经酶切鉴定后测序（上海生工生物工程技术服务有限公司完成）。测序结果提交至Genbank中与已知真菌的18S rDNA序列进行BLAST(http://www.ncbi.Nlm.Nih.gov/BLAST)比对。用MEGA5建发育树。

1.4 筛选菌株急性毒性试验

在PD培养基中接目的菌株菌饼，30℃，180 r/min摇床振荡培养7 d，制成1×108cfu/ml的菌悬液，试验组10只小鼠灌喂菌悬液，每只小鼠灌喂2 ml，每天2次；对照组灌喂PD培养基，连续灌喂14 d。观察并记录小鼠的临床表现，第14 d捕杀小鼠进行病理解剖学及血液生理生化检查。

1.5 产酶条件的测定

1.5.1碳氮源对菌株产酶能力的影响

在无碳基础培养基中增添1%的不同碳源（稻草粉、纤维素粉、可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖）；在无氮基础培养基中增添1%的不同氮源（蛋白胨、尿素、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵）。接种量为1%，培养4 d，测定其内切葡聚糖酶（EG）酶活，检测碳氮源对产酶的影响。

1.5.2 培养条件对菌株产酶能力的影响

以1%的接种量将H-3接种于pH值为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的发酵产酶培养基中，培养 4 d，测定其EG酶活，检测起始pH值对菌株产酶的影响。将H-3以1%的接种量接种发酵产酶培养基中，培养1～7 d，测定其EG酶活，检测培养时间对菌株产酶的影响。以1%的接种量将H-3接种发酵产酶培养基中，分别在25、28、30、33、35 ℃条件下培养4 d，测定其EG酶活，考察培养温度对菌株产酶的影响。

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2 结果与分析

2.1 产纤维素酶菌株的筛选

采集的样品经过涂布、划线分离纯化到15株菌株，将获得的真菌进行刚果红染色水解圈的测定，其中有4株真菌产生明显的水解圈，而H-3的水解圈最明显，均高于其他菌株，表明其具有较强的产纤维素酶的能力。将4株菌株接入发酵产酶培养基，测得的纤维素酶活力和滤纸酶活力见表1。由表1可以看出H-3的酶活最高，羧甲基纤维素酶活力为237.428 IU/ml，滤纸酶活力为21.278 IU/ml。

表1 不同菌株的透明圈与菌落直径比值及酶活

以1%的接种量在玉米秸秆发酵培养基中接种菌株H-3，28 ℃、180 r/min摇床培养，间隔24 h测定H-3菌株纤维素酶活，结果见表2。由表 2可知，H-3培养72 h时酶活最高，内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶分别为10.325、8.757、9.478 IU/ml。

表2 菌株H-3纤维素酶活力（IU/ml）

2.2 菌株鉴定

2.2.1 形态鉴定

菌落为白色圆形，中部粉状，边缘绒状，背面淡黄棕色，见图1。营养菌丝无色，直立，有隔膜，分生孢子单细胞，无色，分生孢子梗锥形见图2。根据《中国真菌志》，依形态学特征初步鉴定菌株H-3为枝孢属枝顶孢属(Acremoniu)。

图1 H-3菌落形态特征

图2 H-3菌丝的形态

2.2.2 分子生物学鉴定

拼接测序结果，登录NCBI数据库进行BLAST比对，选取同源性较高的模式菌株进行建树分析，见图3。结果显示菌株H-3与Acremonium sp.GU985206.1亲缘关系最近。由形态学和分子生物学鉴定该菌株为枝顶孢属（Acremonium）。

2.3 筛选菌株急性毒性试验

饲料添加菌株需安全无毒，因此对筛选菌株进行急性毒性试验研究。试验组小鼠试验期间活动与生长均正常，未出现中毒症状，第14 d解剖，各组织器官均正常（见图4）。检测血液指标，各指标试验组与对照组没有明显差距（见表3），初步表明菌株H-3没有毒害作用。

图3 菌株H-3与相关菌株的系统发育树

图4 毒性试验内脏观察结果

表3 血液指标测定结果

2.4 产酶条件测定结果

2.4.1 不同碳源对产酶结果的影响（见表4）

表4 不同碳源对产酶的影响

2.4.2 不同氮源对产酶结果的影响（见表5）

表5 不同氮源对产酶结果的影响

表5可以看出，以无机氮做为氮源，产酶最高的为(NH4)2SO4，其酶活力为12.37 IU/ml，优于有机氮源酶活力，因此，菌株发酵产酶的最适氮源为硫酸铵。

2.4.3 初始pH值对产酶结果的影响（见图5）

图5 不同pH值对产酶结果的影响

由图5可以看出，产酶的最适pH值是6.5，同时该菌株在pH值5～6.5时产酶效果好。

2.4.4 不同培养时间对产酶结果的影响（见图6）

图6 培养时间对产酶结果的影响

由图6可以看出，在发酵前期（24～48 h）主要是菌丝生长旺盛阶段，产酶量极低。在发酵72～96 h后产酶量开始增加，达到产酶的高峰期，然后逐渐降低，若再增加培养时间，酶活反而下降。

2.4.5 培养温度对产酶结果的影响（见图7）

图7 培养温度对产酶结果的影响

图7表明，菌株H-3在25℃产酶能力最低，酶活为8.78 IU/ml，随着温度的升高，产酶能力增强，28℃酶活最高，其酶活力为12.47 IU/ml，温度再升高，而酶活降低。

3 讨论

纤维素类物质是地球上最为丰富的再生资源，提高纤维素利用率可有效解决世界能源危机、粮食短缺、环境污染等问题，其中纤维素酶水解作用是解决这一环节的重要物质。因此，选育高产纤维素酶的菌株，对提高富含纤维素资源的再利用具有重要意义。纤维素酶是一种复合酶，主要包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，3种酶协同作用降解纤维素。本试验从腐木和腐烂秸秆土壤中利用刚果红纤维素培养基分离筛选得到15株菌株，并利用滤纸条降解试验，获得一株最优产酶菌株H-3，测定其内切纤维素酶、外切纤维素酶、β-葡萄糖苷酶分别为10.325、8.757、9.478 IU/ml。通过平板培养、形态特征观察以及分子生物学鉴定，其与Acremonium sp.GU985206.1同源性达到99.26%，鉴定该菌株为枝顶孢属（Acremonium）。急性毒性试验测定菌株的安全性，发现小鼠均无异常，表明该试验中筛选得到的H-3为实际无毒物质。内切葡聚糖酶在纤维素降解过程中具有重要作用，且能有效的消化饲料中各种营养成分，因此，本试验对菌株H-3产内切葡聚糖酶条件进行优化，确定H-3最适发酵条件为：麸皮分为碳源，硫酸铵为氮源，初始pH值6.5、28℃培养96 h,酶活为13.57 IU/ml，较优化前提高了2.36 IU/ml。

目前，自然界中很多微生物都能有效降解纤维素并转化成可利用资源，现在已发现能降解纤维素的菌株有虫拟蜡菌(Ceriporiopsis subvermispora)、粉孢革菌(Coniophora puteana)、地窖粉孢革菌(Coniophora cerebella)、康宁木霉(Acrostalagmus koningii)和里氏木霉(Trichoderma reesei)等，但枝顶孢属(Acremonium sp.)产纤维素酶的研究报道相对较少，本试验筛选获得的枝顶孢属菌株H-3扩大了降解纤维素菌种来源，且产内切葡聚糖酶能力强，因此具有很好的开发前景。