脂肪来源干细胞修复创面的研究进展

张元政， 邢 新， 杨 超

综 述

脂肪来源干细胞修复创面的研究进展

张元政， 邢 新， 杨 超

创面； 脂肪来源干细胞； 临床研究

创面修复是指机体遭受外力作用后，皮肤肌肉等组织出现离断或损伤后的修复过程，其中包括各种组织的再生和肉芽组织增生瘢痕形成等复杂的病理生理过程。一般的创面通过缝合可促进其愈合。而大面积烧伤、挤压伤、糖尿病患者，因创面损伤大，愈合能力差，往往形成不愈合创面。目前，临床多采用皮瓣或皮片移植来修复此类创面，但是存在着供皮区组织缺损及瘢痕形成等缺点。干细胞技术为皮肤组织的修复提供了新的思路。常用的干细胞包括胚胎干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)、人工诱导多能干细胞等。ADSCs是Zuk等[1]从脂肪组织中获取的一类多能干细胞。ADSCs具有取材方便、来源充足、容易培养等优点，且具有向3个胚层分化的能力，并可以分泌多种细胞因子[2]。在创面修复中，将ADSCs结合或者不结合的支架材料植入皮肤缺损处，通过向表皮细胞分化及细胞因子作用等来修复创面。ADSCs与骨髓间充质干细胞相比，甚至表现出更好的创面愈合能力[3]。

1 ADSCs促进创面愈合的机制

1.1 旁分泌作用 生长因子或细胞因子能促进相应细胞迁徙、增生、收缩、分化，改善局部组织的微环境，加快创面的愈合。ADSCs能分泌多种生长因子，调控周边的细胞。

常见的生长因子包括：血小板源性生长因子(platelet derived growth factor, PDGF)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)等。Lee等[4]将皮肤角质细胞与成纤维细胞共同放置于50%ADSCs条件培养基(conditioned medium of ASCs, ASC-CM)中培养发现，ASC-CM上调了成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白的表达，促进成纤维细胞分泌Ⅰ型胶原蛋白。在体外创伤模型中发现，ASC-CM提高了角质细胞与成纤维细胞的增殖能力，增强了成纤维细胞收缩能力。Moon等[5]将角质细胞放置于低氧条件下的ASC-CM中培养。通过DNA基因片段的分析，筛滤了290个发生2倍以上改变的基因片段，发现被调低的基因片段大部分与细胞黏附相关，与DNA复制相关的片段没有一个被调低，与细胞周期相关的基因片段则被大部调高。角质细胞的增殖、迁徙能力获得显著提高。对细胞因子的分析中，发现了肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)、成纤维细胞生长因子-1(fibroblast growth factor-1, FGF-1)、转化生长因子-β3(transforming growth factor-β3, TGF-β3)、VEGF、白介素6(interleukin-6, IL-6)、集落刺激因子(colony stimulating factor， CSF)含量的提升。Kim等[6]发现，ADSCs不仅可以通过细胞间的直接接触，也可以通过旁分泌作用，促进成纤维细胞的增殖和成纤维细胞向创面迁徙。ASC-CM通过上调Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白、纤维连接蛋白和萧条MMP-1 mRNA的表达，促进成纤维细胞分泌Ⅰ型胶原蛋白。在动物实验中，ADSCs能显著减小创面面积，加速上皮化。

1.2 ADSCs分化为组织细胞来修复创面 ADSCs具有多向分化潜能，能分化为组织细胞来修复创面。Altman等[7]以丝蛋白-壳聚糖支架种植绿色荧光蛋白-1标记的ADSCs后用于鼠类创面，术后2周实验组创面部位血管密度较对照组大，成纤维热休克蛋白、平滑肌肌动蛋白和绿色荧光蛋白标记物阳性，并可见ADSCs 分化成上皮细胞。由此可见，ADSCs能分化形成血管、内皮、表皮，修复组织缺损。

1.3 ADSCs促进血管长入创面 局部血运循环对于创面愈合非常重要，血液循环一方面可保证组织再生所需要的氧和营养，另一方面对坏死物质的吸收及控制局部感染起着重要作用。ADSCs用于创面修复能明显提高创面的新生血管密度[8-15]，其机制在于ADSCs旁分泌VEGF、bFGF等细胞因子，促进了血管生长。ADSCs能向血管内皮细胞和平滑肌细胞分化。Zamora等[9]将ADSCs种植于具有三维结构的聚乙二醇-纤维蛋白凝胶，培养3 d后细胞开始出现管状结构，将其种植于动物模型，其内可发现红细胞，血管内皮特异性标志物vWF呈阳性，表示管状结构确实是血管内皮。

2 优化ADSCs治疗创面效果的新技术

2.1 基因改造技术 基因强化技术是利用基因工程技术将编码特定功能因子的基因转入细胞中，使转染细胞表达目的产物。目前研究转入的目的基因，大部分是调控生长因子的基因，通过调整特定生长因子的分泌水平，进而调控细胞的增值、迁徙、分化，加速创面愈合。基因强化技术目前常用的有特定质粒的转染，即通过逆转录或非逆转录病毒诱导的基因转染技术。

Nauta等[16]使用编码VEGF的质粒转染ADSCs，通过在老鼠创伤模型应用中发现，极大地增快了创面的愈合时间，第8天创面的愈合水平，相当于普通ADSCs对照组10～12 d的愈合水平。组织学检查显示，创面纤维蛋白和胶原沉积较对照组增多。Song等[17]通过逆转录酶病毒，将MYC基因和AKT基因转染ADSCs，转染MYC后的ADSCs在与血管内皮细胞的共培养中，血管内皮细胞构成的管状结构明显增多，可见VEGF分泌明显增多，而MYC和AKT共转染的ADSCs在ELISA实验中，表现出有更多的VEGF分泌。在动物创伤模型中，CA-Akt/v-myc hASCs条件培养基相比普通ASC条件培养基，创面愈合更快。组织学检查发现，CA-Akt/v-myc hASCs炎症反应更小，上皮细胞和胶原沉积与正常上皮更加接近。

2.2 细胞膜片技术 细胞膜片是近年兴起的一种组织工程新技术，相比种子细胞，其拥有三维结构，保留了细胞培养时分泌的细胞外基质与细胞因子，膜片化后的ADSCs使用更加方便。近年来，Lin等[8]将ADSCs制备成细胞膜片，尝试用于创面修复。在创面愈合的早期，ADSCs膜片创面愈合速度，较直接使用ADSCs的对照组明显加快。血管密度检测发现，ADSCs膜片创面较对照组增加了15%以上。Cerqueira等[18]同样使用ADSCs膜片来修复全层皮肤缺损创面。实验发现，创面愈合速度较不使用膜片的对照组明显增快。

2.3 缺氧微环境 脂肪组织处于末梢循环，往往处于氧饱和度相对较低的微环境，氧浓度只有约3%。低氧环境对ADSCs的增殖、分化、黏附、迁移、细胞反应、分泌都有影响[19]。Lee等[20]发现，低氧(2%)环境下获得的ADSC-CM较正常浓度下的CM，更能增强皮肤成纤维细胞的迁移，加快胶原沉积。动物实验中，mRNA和蛋白测量显示，低氧上调了VEGF和bFGF表达，使用低氧环境下获得的ADSC-CM能明显地缩小创面面积。对照试验中，研究者使用抗VEGF和bFGF抗体中和了VEGF和bFGF，这减弱了成纤维细胞的迁移和创面愈合能力。可见，VEGF和bFGF的分泌是影响创面愈合的重要原因之一。

2.4 低能激光 低能激光在临床中应用广泛，其不仅能止痛，而且能改善微循环。同时低能激光能促进细胞迁移、增殖，对间充质干细胞还能增加生长因子分泌与分化。Kim等[21]将低能激光(1 J/cm2)结合ADSCs修复创面时发现，激光照射减少了细胞凋亡，从而增加了ADSCs在组织中的成活率，同时激光还增加了VEGF和bFGF的分泌。动物实验表明，低能激光结合ADSCs修复创面，要优于单纯干细胞修复创面，创面的血管化水平和皮肤附件再生水平均得到了提高。

2.5 支架材料 支架材料为ADSCs提供合适的生存和分化微环境，合适的生物支架材料能提高创面修复的效果。Huang等[12]通过对比硅胶和脱细胞真皮作为支架并结合ADSCs用于修复创面，发现种植于脱细胞的支架，有更好的愈合效果。Shen等[11]将脂肪细胞种植在聚乙烯-壳聚糖支架中作为人工真皮用于糖尿病创面的修复，发现能有效加速创面愈合。杨超等[22]制作放射性复合损伤模型。在损伤创面上滴加ADSCs-HA复合物，结果显示，在创面血管新生方面，ADSCs-HA复合物组新生微血管数量明显提高。

随着电纺丝纳米纤维技术的发展，越来越多的材料通过电纺丝技术被用来制成新的细胞支架。Machula等[23]使用电纺丝弹性蛋白原作为支架，结合ADSCs用于大鼠全层真皮缺损创面的研究，发现电纺丝弹性蛋白原与ADSCs有着良好的生物相容性，通过与对照组的比较发现，明显加快了创面愈合。Gu等[24]使用电纺丝聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物作为支架，结合ADSCs修复大鼠创面，加速了创面愈合速度。

3 ADSCs修复难愈性创面

慢性难愈性创面一直是困扰临床医师的难题。难愈性创面可见于创面的慢性感染、糖尿病所致的微循环障碍、放疗等。ADSCs在慢性创面的动物实验中，发现能促进伤口的愈合。

3.1 糖尿病慢性溃疡 糖尿病患者皮肤易损伤，损伤后往往反复发作，迁延不愈，形成难愈性创面。ADSCs用于糖尿病创面的治疗，为改善创面预后提供了新的思路。Zografou、Kim、Maharlooei等[10,25-26]将ADSCs注射于糖尿病老鼠创面边缘，均发现创面的愈合速度较对照组高，实验组在上皮化、胶原沉积、血管生成等方面有较明显改变。Nambu等[27]将分离出的初代ADSCs结合带硅胶膜片的胶原蛋白支架，移植在糖尿病模型老鼠的全层缺损创面，创面愈合时间较对照组缩短，上皮化水平、毛细血管密度都有明显提高。Nie等[28]将ADSCs结合脱细胞真皮支架用于糖尿病老鼠的创面，蛋白定量分析显示，VEGF、HGF等血管生成相关的细胞因子表达大幅上调，这使得创面血管密度、上皮化水平、组织增生有明显提高，这些促进了创面的愈合。

3.2 放射创面 放射损伤能造成细胞损坏并伴随诸多的调控失调，从而延缓创面愈合。Haubner等[29]用2-12Gy辐射照射真皮血管内皮细胞与ADSCs共培养的模型发现，ADSCs能降低内皮细胞接受辐射后引起的多种细胞因子和黏附因子的表达水平，从而稳定创面，加快愈合。Forcheron等[30]将ADSCs皮内注射于受辐射的小型猪，80%的猪创面得以愈合，而对照组则全部发生坏死。免疫组化分析角蛋白表达显示，创面完全上皮化。Huang等[31]用ADSCs治疗接受辐射的老鼠，3周后创面较对照组有明显缩小，组织检查和免疫印迹显示，创面边缘再上皮化区域有血管长入；细胞追踪实验显示，创面中的ADSCs表达血管内皮标志物。

综上所述，ADSCs对于创面的愈合改善有一定的作用，其机制和效率仍有待进一步研究。如何提高ADSCs修复创面的效率也是最近研究的热点，对干细胞的基因改造、细胞微环境改善、细胞膜片技术，都在实验室得到了一定肯定，但是在临床应用中，其安全性仍有待考证。相信随着今后对ADSCs更深入地研究，其在临床中用于修复复杂性难愈性创面将可能实现。

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200433 上海，第二军医大学附属长海医院 整形外科

张元政(1989-)，男，浙江人，住院医师，硕士研究生.

杨 超，第二军医大学附属长海医院 整形外科，电子信箱：13916086222@163.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2014.12.015

2014-10-12)