共培养体系在血管化组织工程脂肪中的应用进展

刘刚强, 刘 毅

综 述

共培养体系在血管化组织工程脂肪中的应用进展

刘刚强, 刘 毅

脂肪来源干细胞； 组织工程； 种子细胞

脂肪组织工程技术的出现为广大的软组织缺损患者带来了希望。目前虽已取得了很大的成绩，但仍存在诸多不足，面临着移植物再吸收、纤维组织替代、油脂囊肿形成等一系列问题[1]。如何有效地保证移植工程脂肪长期存活，并保持其旺盛增殖状态以及维持脂肪细胞特性，是脂肪组织移植成功的关键。任何组织的存活都离不开营养支持，脂肪组织也不例外。浅层脂肪细胞尚可通过血液弥散作用摄取一定营养，而这种弥散范围是相当有限的；深部的脂肪细胞只有通过血管来保持有效的物质交换，血管形成在脂肪组织工程中起着相当重要的作用[2]。如何建立血管化工程脂肪成为近年来人们研究的热点问题[3]。脂肪组织工程中的共培养策略，主要是将种子细胞与内皮或内皮祖细胞共同培养，以在工程脂肪中建立良好的血供为目的，为解决移植脂肪细胞在体内难以长期存活的难题，提供了一条新的思路。共培养体系不仅运用于骨组织工程、血管组织工程、肌肉组织工程等领域，近年来在脂肪组织工程中也得到了广泛的运用。笔者从血管化脂肪组织工程共培养体系的细胞来源、作用机制、支架材料及培养条件等方面作一综述。

正常成年人脂肪组织由脂肪细胞及其周围基质成分构成，其中有50%的细胞成分为脂肪细胞，体积约96%，余为血管、神经及结缔组织，体积占4%。脂肪组织中有丰富的血管供给，血液供给与毛细血管的密度是骨骼肌中的2～3倍。每个脂肪细胞至少都与一根毛细血管相接触。在脂肪组织中，脂肪细胞与内皮细胞相互作用，还可共同调节脂肪组织的生长情况。因此，在脂肪组织工程中，建立与内皮细胞的共培养体系对脂肪组织工程具有重要的意义。

1 脂肪组织工程中共培养体系的细胞来源

目前，脂肪组织工程种子细胞主要为成体干细胞，迄今为止，运用最多的为骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs)、脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)、脐血间充质干细胞(mesnchymal stem cells, cbMSCs)。内皮细胞(endothelial cells, ECs)与内皮祖细胞(endothelial progenitor cells, EPCs)为共培养体系常用于构建血管化工程脂肪的细胞。

BMSCs具有充足的来源，较强的分化与增殖能力及良好的可塑性，一直以来是脂肪组织工程主要的种子细胞来源，但其有在骨髓中含量较低，不易获取且容易引起供区并发症等缺点[4]。ADSCs具有来源充足，容易获取，患者痛苦小，且可以自身取材，克服异体免疫排斥反应，不易引起供区并发症等优点，成为脂肪组织工程的理想种子细胞[5]。近年来，有较多将其用于血管化工程脂肪构建共培养体系的报道[6]。

ECs是血管内壁的单层细胞，可以分泌多种血管活性物质，在血管构建方面有重要作用[7]。ECs是目前最常用于共培养体系构建血管化工程脂肪的细胞，通过内皮细胞与种子细胞间相互作用，可促进移植物血管形成与血管新生。根据来源不同，可以分为大血管内皮细胞和微血管内皮细胞，人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVEC)为最常见的大血管内皮细胞，也可来源于大隐静脉、主动脉等血管内壁。微血管内皮细胞可以在脂肪及肺等组织中获得。由于具有新生儿脐带容易获得，来源充足，取材方便等优点，HUVEC成为共培养体系中最常用的细胞来源之一[8]。EPCs为血管内皮的前体细胞，能分化为成熟的内皮细胞，可以从脐血、脂肪及骨髓中分离提取。由于具有较好的成血管能力和生物活性，近年来，在构建共培养体系中得到较多应用[9]。但由于内皮祖细胞存在数量较少，提取困难，不易纯化，缺乏特异标志分子而鉴别困难等缺点，限制了其在临床上的应用[10]。

2 共培养体系促血管化工程脂肪的作用机制

构建血管化工程脂肪是脂肪组织工程中共培养策略的主要目的，无论在体内还是体外实验中，工程脂肪的长期存活必须依赖血管提供营养，尤其对于大而深弥散无法达到的组织而言，更需要血液的供给[11]。由于很多组织都是富含血管组织，因此，建立有效的血管网络，并使宿主的血液可以灌注到构建的组织中来，是当前组织工程领域一个重要的课题。

共培养体系中，每2种细胞之间的作用方式有以下2种：①直接接触作用。两种细胞通过直接接触，促进细胞产生一定的生物学效应。②间接接触作用，即旁分泌作用。一种细胞释放一种特定的物质，与另一种细胞表面的受体结合，促进其产生一定的生物性效应[12]。ECs三维培养发现，其具有聚集并成管状结构的特性，但在支架上长期单独培养，却很难保持其持久的增殖性。然而，在干细胞与内皮细胞的共培养中，内皮细胞可以刺激干细胞，促进血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)及血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF)释放，进一步刺激内皮细胞，使其可以聚集并形成微血管结构[13]。促进内皮细胞成微血管的主要因子除了以上两种外，还有：碱性纤维生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)、内皮生长因子(endothelial growth factor, EGF)、胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor 1, IGF-1)等[14]。Strassburg等[15]通过研究比较ADSCs对HUVEC及EPCs成血管的作用发现，ADSCs主要增强了内皮祖细胞的成血管能力，而对HUVEC作用较弱。但Sandra在CAM模型上进行血管化工程脂肪研究中发现，HUVEC组却比EPCs组形成更丰富的血管网络[12]。在成纤维细胞与内皮细胞共培养的研究中发现，与ECs接触不仅可以刺激成纤维细胞释放VEGF，上调内皮细胞表面的VEGFⅡ型受体，还可激活内皮细胞的氮氧合酶，释放血管活性物质一氧化氮[16]。Jennifer将ADSCs与HUVEC在丝素蛋白上三维培养，通过对甘油三酯、成脂基因及基础脂解分析发现，HUVEC对ADSCs的成脂功能具有促进作用[17]。另外，共培养体系也可调节干细胞分化与再生。在工程脂肪构建策略中，种子细胞一部分既要分化为成熟脂肪细胞，一部分又要保持干细胞的特性。保持其强烈增殖与多分化的能力，传统上可以使用滋养细胞释放出一些生长因子、细胞因子及营养素等，通过调节细胞间的信号联系，保持干细胞存活并增殖。共培养体系也被用于保持种子细胞“干性”。

3 脂肪组织工程中共培养体系的支架材料

共培养体系中除了细胞间相互作用外，细胞与支架材料也将起着相当重要的作用，并可对细胞间作用产生一定的影响；通过对支架材料的改性，可以改变一种细胞的表型，进而影响到另一种细胞的功能。这些可以改变的支架材料特性包括：表面化学修饰、表面形态、空间模式、孔隙率、可湿性、带电性及机械性能等[18]，可根据实验的目的和涉及的细胞类型来选择材料的不同特性[19]。聚丙烯酰胺(polyacrylamide, PAM)修饰的支架材料有利于与内皮细胞共培养体系的构建，微孔系统对干细胞的分化有促进作用[20]。支架材料的孔隙率与细胞的迁移扩散相关联[21]，对于构建血管化工程脂肪有重要的意义。Yao等将ADSCs种植于胶原蛋白/藻朊酸盐微球，再与HUVEC共培养，注射在大鼠头部，成功构建出了血管化工程脂肪[22]。

鸡胚绒毛尿囊膜(chorioallantoic membrane, CAM)是鸡胚胎发育过程中，位于胚胎外富含血管的膜性结构，具有低免疫原性，常被用于血管化组织工程的研究中。通过分析是皮细胞与干细胞共培养能够促进CAM中血管长入细胞团中(血管形成)，内皮细胞形成的管状结构能否与宿主血管建立有效的连接(血管新生)，表明CAM是血管化研究中比较稳定的模型[12]。

纤维连接素(fibronectin, FN)既可以促进细胞的粘连与生长，也可提高细胞的融合率，有效缩短融合周期。Strassburg等[12]以纤维连接素作为共培养体系的细胞外基质，成功构建出血管化丰富的工程脂肪。

甲基纤维素(methyl cellulose, MC)凝胶微球被用来作为共培养体系研究的支架材料。Chen等[23]将HUVEC与cbMSCs种植，与MC凝胶微球材料共培养，注入后肢缺血的大鼠模型体内，发现新生血管可以提供缺血组织血供，明显改善组织缺血坏死。

此外，传统的脂肪组织工程支架材料，如胶原蛋白、丝素蛋白及PLG等材料，也常被运用在血管化脂肪组织工程共培养体系中。

4 共培养体系的条件与比例

在单种细胞培养中，不同的细胞拥有不同的培养基，然而在共培养体系中，如何使用一种培养基而使两种细胞都能保持正常增殖状态与特性，目前尚无统一的定论。通常是将两种培养基按照一定的比例混合，混合的比例取决于不同细胞类型在实验中的重要性[24]。共培养体系中两种细胞的培养比例，在各种实验中也有较大不同，大多数研究者按照1∶1的比例进行实验，成功获得血管化的工程脂肪。但Strassburg等[12]的研究将两者比例设在1∶10～1∶40间。究竟共培养体系中两种细胞比例如何配置才能创建出理想的工程脂肪，血管化到什么程度才能既保证脂肪细胞长期存活，又可达到脂肪组织的功能？应先将内皮细胞种于支架并建立有效的血管网络，还是先将MSC种于支架材料形成有效的脂肪？尚需进一步研究证实。

5 脂肪组织工程中共培养体系的二维及三维培养

传统的二维培养主要用于研究共培养细胞间分子的相互作用，将间充质干细胞与内皮细胞直接接种于培养皿内，通过细胞接触或者旁分泌的细胞因子作用，比较观察两种细胞对彼此生长增殖及功能的影响，从而分析两种细胞间相互作用的分子机制。三维培养是将两种细胞种植于同一三维支架材料上，可以为构建血管化工程脂肪提供更良好的微环境。三维培养能更好地模拟人体细胞的生长环境，分析细胞形态及微血管的形成与生长。

6 展望

过去很长一段时间，许多研究者专注于单一细胞生物材料的研究。然而，在人体生理环境中，绝大多数组织都是由2种或2种以上类型细胞所组成的多细胞系统，细胞相互之间的作用有利于细胞的生存与增殖，促进生长因子等活性分子的产生，增强细胞分化能力及其他关键的生物学作用。尽管共培养体系的构建还存在诸多问题，如：适合各种细胞共培养的支架材料、培养基问题；各种不同类型细胞间的相互作用及机制；共培养体系中不同细胞的比例问题等。但最近共培养体系越来越多地引起人们的重视，逐渐成为组织工程发展的新方向。无论是从生理学还是生物学上讲，共培养体系都更加接近天然组织，具有不同类型细胞间相互作用的特性。相信在不久的将来，随着实验技术与方法的不断改进，共培养体系将成为构建血管化脂肪组织工程的重要策略，具有广阔的应用前景。

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730050 甘肃 兰州,兰州军区兰州总医院 全军烧伤整形中心

刘刚强(1985-)，男，甘肃天水人，住院医师，硕士研究生.

10.3969/j.issn.1673-7040.2014.12.013

2014-08-15)