绵羊肺炎支原体溶血素TlyC基因的克隆及分子特征分析

胡政香，孟庆玲＊，乔 军，赵海龙，马 玉，刘田莉，赞哈尔·波拉提，才学鹏，陈创夫

（1.石河子大学动物科技学院，新疆石河子832003；2.中国农业科学院兰州兽医研究所，甘肃兰州730046）

绵羊肺炎支原体（Mycoplasmaovipneumoniae，MO）是引起绵羊传染性胸膜肺炎（Contagious ovinepleuropneumonia）的一种慢性呼吸道疫病的病原，它不仅能感染绵羊，同时也可感染山羊，主要危害1月龄到3月龄的羔羊，在临床上以高热流鼻涕、咳嗽、渐进性消瘦和增生性间质性肺炎为主要特征［1－3］。此外，羊感染MO 后，会出现免疫抑制，引起其他病原继发感染，导致感染动物死亡［4－5］。

新疆是我国五大牧区之一，绵羊养殖业在畜牧业中占有重要的地位。近几年，在新疆多个地区种羊场先后疑似绵羊传染性胸膜肺炎的疾病，发病率可达40～60%，给新疆养羊业造成了很大的经济损失。因此，开展MO 病原学及致病机制研究对于该病的科学防控具有重要的意义。然而，目前有关MO 研究较少，尤其是对于重要毒力因子缺乏了解，因此对其致病分子机制知之甚少［6］。2013年，有人首次对MO SC01株进行全基因组的测序研究，预测和发现了MO 的一些重要毒力基因［7］。为了研究MO 毒力因子，本试验对MO 新疆分离株溶血素（hemolysin，TlyC）进行克隆和测序，并对TlyC基因及其编码氨基酸序列进行分子特征分析，旨在了解MOTlyC生物学功能及其在致病中的作用。

1 材料与方法

1.1 菌株及试剂

绵羊肺炎支原体新疆分离株（MO XJ分离株）分离自新疆某羊场送检的疑似MO 感染羊的病料。LB培养基由本研究室自配（10g胰蛋白胨，10g氯化钠，5g酵母提取物，加蒸馏水定容至1L）。Taq plus DNA 聚合酶、dNTPs、琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒购自上海生物工程公司，pMD18－T 载体和2000bp DNA Ladder Marker均购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.2 引物设计与合成

根据GenBank中发表的TlyC基因序列（WP＿010320917），采用Premier 5.0引物软件设计绵羊肺炎支原体TlyC 编码序列的特异性引物：上游引物TlyC－f：5＇－ATGCCGGGTTATTTTATTG－3＇；下游引物TlyC－r：5＇－TTAGCTTTTTTGTTGGAATTC－3＇。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 MO 基因组的提取

将病料置于研磨器中加适量的蒸馏水，进行研磨，然后按照DNA 提取试剂盒说明书操作进行提取支原体DNA。

1.4 PCR 扩增及序列克隆

设计总反应体系为50μL，体系成分：取提取的DNA 模板2 μL，10×PCR Buffer 5 μL，2.5 mmol／L dNTPs 4μL，TlyC－f（25μm／L）、TlyC－r（25μm／L）各1μL，d3H2O 36.8μL，Taq DNA 聚合酶（5 U／μL）0.2μL 混匀。反应条件为：预变性95 ℃3min 20s，变性94 ℃40s，退火50 ℃40s，延伸72 ℃1min 30s。最后降温至4 ℃保存。

将PCR 产物在1.0%琼脂糖凝胶，以0.5×TAE缓冲液，130V 电压电泳12min。电泳完成后，置于电泳凝胶紫外成像仪中观察。对扩增得到的PCR粗产物再用回收试剂盒进行纯化回收。将纯化回收产物片段和载体pMD18－T 连接过夜，次日转化感受态细胞E.coliDH5α，在氨苄青霉素平板上进行筛选，然后做菌落PCR反应进一步筛选验证。

1.5 序列测定与分子特征分析

图1 TlyC 序列PCR 扩增结果1－4.基因扩增产物；5.阴性对照；M.2000bp DNA Ladder MarkerFig.1 Amplification product test results of hemolysin TlyCgene by PCR1－4.gene amplitication product；5.negative control；M.2000bp DNA Ladder Marker

图2 TlyC 序列阳性克隆菌落PCR 扩增结果1－4.菌液PCR 扩增产物；5.阴性对照；M.2000bp DNA Ladder MarkerFig.2 Amplification product test results of TlyCgene of MO1－4.bacteriun solution PCR amplificantion product；5.neg－ative control；M.2000bp DNA Ladder Marker

将验证正确的重组载体产物送至生工生物工程（上海）有限公司直接测定核苷酸序列。利用生物在线分析软件（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／SignalP／，http：／／www.expasy.org／tools／）对TlyC基因编码氨基酸序列进行理化性质、信号肽、跨膜区、结构域、二级及三级结构等分析，采用NJ法（Neighbor－Joining Method），应用MEGA5.0等软件对MO 新疆分离株和GenBank中发表的MO 及相关支原体菌株的溶血素基因序列进行系统进化分析。

2 结果

2.1 PCR 扩增与克隆结果

经1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，成功扩增得到大小约为1 239bp的核酸片段（图1）。与预期大小相符；阳性克隆菌菌液也能扩增出相同大小生物核酸片段，表明成功克隆出TlyC基因（图2）。

2.2 TlyC 基因测序结果及其序列分析

经测序，TlyC基因全长1 239bp，含起始密码子ATG，终止密码子TAA，编码412个氨基酸，分子量约为42.5kDa。Signal IP 3.0Server在线软件分析TlyC基因编码的氨基酸序列，发现第1～23个氨基酸为信号肽序列。分析发现，疏水性氨基酸均匀分布在整个肽链中，且多于亲水性氨基酸。TMHMM 软件分析发现，TlyC存在四个跨膜结构域（4－26、62－84、94－116、123－145）。Prosite scan软件分析发现，TlyC存在两个CBS（胱硫醚β合成酶）（204－251和260－310）。CBS 结构域常出现在各种具有相互作用的蛋白上，CBS可能在蛋白与蛋白的相互作用中起着重要的调控作用（图3）。

2.3 TlyC 蛋白二级及三级结构预测和分析

MOTlyC蛋白二级结构预测发现，TlyC二级结构包括248个氨基酸（占55.83%）可能形成α－螺旋（h）、76个氨基酸（占18.45%）可形成延伸链（e）、78个氨基酸（占18.93%）可形成无规卷曲（c）、28个氨基酸（占6.80%）可形成β－转角（t），但没有β－折叠。由此可知该蛋白质主要以α－螺旋为主（图4）。三级结构呈一个L型球蛋白的结构（图5）。

2.4 TlyC 基因相似性比较及遗传进化分析

用DNAMAN 软件氨基酸预测同源性得出；MO 新疆分离株与猪肺炎支原体232 株相似性为81.95%，与絮状支原体相似性为80.49%，除此之外与结膜支原体、毛氏霉形体、猪鼻支原体HUB－1株也具有较高相似性，三者间氨基酸序列相似性分别60.68%、59.71%和48.53%。用MEGA5.0软件分析GenBank中发表的猪鼻支原体、猪肺炎支原体、絮状支原体、滑液囊支原体、结膜支原体等株TlyC基因绘制了系统进化树见图6。由图6 知，MO 新疆分离株与猪肺炎支原体232株，絮状支原体聚为一支，亲缘关系较近，而与其他株的亲缘关系相对较远，表明MO 新疆分离株与猪肺炎支原体232株和絮状支原体可能来自同一祖先。

图3 TlyC 基因核苷酸及其编码氨基酸序列TlyC 基因含有的信号肽位于序列的第1～23位（红色波浪线标定字体）；4个跨膜区（方框）；4个N 末端糖基化位点（加粗斜体）；2个CBS（灰色区）Fig.3 Nucleotide sequence and amino acids sequence of serine protease of TlyCThe signal peptide of the TlyCgene located in the sequence of 1～23is underlined with a red wavy line calibration font；the 4transmembrane regions are underlined with box respectively；the 4N－terminal glycosylation sites are underlined in bold and italic；2CBS（gray area）

图4 TlyC 二级结构的预测Fig.4 Prediction of secondary structure of TlyC

3 讨论

自从1963年首次分离到MO 后，世界各国和地区陆续发现此病，目前其在全球范围内分布，给养羊业带来了巨大的经济损失［8－13］。在国内，胡景韶等［1］首次从发病绵羊上分离得到，并随后在辽宁、云南、甘肃、四川、江苏、新疆等地都有从患肺炎绵羊中分离到的报道，证实我国广泛存在绵羊支原体肺炎病［14－16］。新疆是我国五大牧区之一，也是我国重要的养羊基地，近几年从内地引进了大批湖羊，实行集约化饲养，在引进后先后在数个湖羊种羊场爆发该病，常规治疗无效，发病率和病亡率很高，给新疆养羊业造成了巨大的经济损失。2012年，通过对12个新疆养羊场抽样调查表明，新疆绵羊MO 的感染率为在32.6%～64.6%，病死率在8%～10%之间。

图5 TlyC 三级结构的预测Fig.5 Prediction of tertiary structure of TlyC

图6 采用NJ法基于TlyC 基因的系统发生分析Fig.6 Phylogenetic analysis of Mycoplasmao vipneumoniae based on TlyCgene with Neighbor－Joining（NJ）MethodHemolysin C Mycoplasma alkalescens，WP＿002882049；Hemolysin C Mycoplasma auris，WP＿004424724；Hemolysin C Mycoplasma arginini（WP＿004415532）；Hemolysin C Mycoplasma hominis ATCC 23114（YP＿003302648）；Hemolysin C Mycoplasma fermentans JER（YP＿003923114）；Hemolysin related protein Mycoplasma agalactiae（YP＿003515428）；Hemolysin－like protein Mycoplasma agalactiae PG2（YP＿001256381）；Hemolysin C Mycoplasma crocodyli MP145（YP＿003560070）；Hemolysin C Mycoplasma synoviae 53（YP＿278547）；Hemolysin C Mycoplasma hyorhinis HUB－1（YP＿003856243）；Hemolysin Mycoplasma moatsii（WP＿022934672）Hemolysin C Mycoplasma conjunctivae HRC581（YP＿002960689）；Hemolysin Mycoplasma hyopneumoniae 232（YP＿116171）；Hemolysin C Mycoplasma flocculare（WP＿002557956）；Hemolysin C Mycoplasma pulmonis UAB CTIP（NP＿326345）；Hemolysin activation protein Ruminococcus albus（WP＿002853574）

MO 不但引起绵羊支原体肺炎，而且还能引起机体出现免疫抑制，易继发其他病原感染，导致较高的死亡率。然而，目前有关MO 毒力基因及其致病分子机制研究较少［2］。溶血素（TlyC）被认为是许多病原菌的主要致病因子，能导致红细胞膜破裂发生溶血，在支原体致病过程中发挥重要作用。本研究以MO 溶血素TlyC为研究对象，对TlyC基因的氨基酸序列组成、结构域、二级和三级结构、同源性及遗传进化关系等进行预测和分析。预测结果显示：扩增所得的TlyC 序列为1239bp；多肽链表现为疏水性；在第1～23位有信号肽、3个N 末端糖基化位点、4个跨膜结构；以α－螺旋为主要二级结构元件，具CBS结构域的功能位点。同源性分析得知，MO 新疆分离株TlyC与猪肺炎支原体232株和絮状支原体相应的TlyC基因相似性分别为81.95%和80.49%；同时，MO与结膜支原体、毛氏霉形体、猪鼻支原体HUB－1株也具有一定的同源性，三者TlyC基因核苷酸同源性性分别60.68%、59.71%和48.53%。遗传进化树显示，MO 新疆分离株与猪肺炎支原体232株和絮状支原体相处于同一枝，表明三者的亲缘关系较近，与其他的株亲缘关系较远。本研究首次克隆了MOTlyC基因，为了解MO TlyC生物学功能及其致病中的作用奠定了前期基础。

［1］胡景韶，将学良，胡诚隆，等.一种支原体感染的绵羊增生性间质性肺炎的研究［J］.中国兽医杂志，1982（5）：2－6.

［2］杨发龙，张焕容，汤 承，等.绵羊肺炎支P113基因的序列分析及功能预测［J］.华南农业大学学报，2013，34（1）：117－120.

［3］韩 笑.绵羊肺炎支原体HSP70 基因遗传多样性及其在分子检测中的应用［D］.四川成都：西南民族大学，2012：1－14.

［4］丁卫华，黄 蓓.绵羊支原体肺炎的诊治［J］.中国兽医杂志，2002，38（7）：21－32.

［5］许 健，储岳峰，高鹏程，等.绵羊肺炎支原体丙酮酸脱氢酶E1－琢亚单位基因（pdha）的克隆、表达及其免疫学活性测定［J］.农业生物技术学报，2012，20（3）：275－282.

［6］王镜岩，朱圣庚，徐长法.生物化学：上册［M］.3版.北京：高等教育出版社，2002：222－223.

［7］Yang F，Tang C，Wang Y，et al.Genome sequence of Mycoplansma ovipneunoniae stais SC001［J］.J Baeteriol，2011，193（18）：5 018.

［8］DaMassa A J，Wakenell P S，Brooks D L.Mycoplasmas of goats and sheep［J］.J Vet Diagn Invest，1992，4（1）：101－113.

［9］Besser T E，Cassirer E F，Potter K A，et al.Association of Mycoplasma ovipneumoniae infection with population－limiting respiratory disease in free－ranging Rocky Mountain bighorn sheep（Ovis Canadensis canadensis）［J］.J Clin Microbiol，2008，46：423－430.

［10］Parham K，Churchward C P，McAuliffe L，et al.A high level of strain variation within Mycoplasma ovipneumoniae population of the UK has implications for disease diagnosis and management［J］.Vet Microbiol，2006，118：83－90.

［11］Besser T E，Hiqhland M A，Baker K，et al.Causes of pneumonia epizootics among bighorn sheep，western United States，2008－2010［J］.Emerg Infect Dis，2012，18（3）：406－414.

［12］Rifatbegovic M，Maksimovic Z，Hulaj B.Mycoplasma ovipneumoniae associated with severe respiratory disease in goats［J］.Vet Rec，2011，168（21）：565.

［13］Giangaspero M，Nicholas R A，Hlusek M，et al.Seroepidemiological survey of sheep flocks from Northern Japan for Mycoplasma ovipneumoniae and Mycoplasma agalactiae［J］.Trop Anim Health Prod，2012，44（3）：395－398.

［14］付海辉，辛培尧，许玉兰，等.几种经济植物UFGT基因的生物信息学分析［J］.基因组学与应用生物学，2010，30（1）：92－102.

［15］翟中和，王喜忠，丁明孝，等.细胞生物学［M］.北京：高等教育出版社，2007：91.

［16］王汉屏.不同植物防御素的生物信息学分析［J］.植物生理学通讯，2008，44（1）：21－31.