产木质素过氧化物酶黑木耳菌株的筛选及酶活力的测定

于德涵,黎 莉,苏 适

（绥化学院食品与制药工程学院,黑龙江绥化 152000）

产木质素过氧化物酶黑木耳菌株的筛选及酶活力的测定

于德涵,黎 莉,苏 适

（绥化学院食品与制药工程学院,黑龙江绥化 152000）

为获得产木质素过氧化物酶的黑木耳菌株,从野外采集的37株黑木耳菌株中筛选产木质素过氧化物酶单株,最终得到2株目标菌株,并测定其产酶活力,2株黑木耳分泌Lip最高酶活力分别为0.021和0.035U·mL-1。

黑木耳；木质素过氧化物酶；筛选；酶活测定

木质素降解酶包括漆酶（Lac）、锰过氧化物酶（MnP）和木质素过氧化物酶（Lip）,是微生物降解木质素的最主要也是最有效的酶类［1］。Lip分子内含亚铁血红素的过氧化物酶,具有较差的底物专一性,可和苯酚、芳香胺、芳香醚、多环芳香化合物等多种不同的木质素模型化合物反应,对木质素广泛的分解特性使Lip在木质素的降解过程中发挥重要的作用。木质素降解酶是微生物分解植物纤维木质素的重要酶类,有证据显示,多种食用菌胞外酶活力尤其是木质素降解酶的活力与其栽培产量呈正相关［2］。黑木耳（A.auricula-judae）的木质素降解酶体系中仅包括2种Lac和MnP,而仅有少量品种或菌株有木质素过氧化物酶产生［3-4］。因此,寻找或培育产木质素降解酶的黑木耳优良菌株,一方面有利于人们进一步了解该酶的特性,并为提高人工栽培黑木耳筛选优良菌种奠定物质基础；另一方面更有利于黑木耳对秸秆、稻草等木屑替代栽培物的降解,提高秸秆、稻草等农田废弃物的利用率,降低代料栽培黑木耳的成本,减少对森林资源的浪费。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菌株为野生黑木耳菌种TH1～TH37,共37株,均采自黑龙江省伊春桃山林业局。

试剂有天青B（AzureB,美国Sigma公司）,其他试剂皆为国产分析纯。主要仪器有752型紫外分光光度计、BILON-HW-10型恒温水浴锅、SIGMA2-16PK冷冻高速离心机、CLG-32L立式全自动高压蒸汽灭菌器、PHS-3C型数显pH计、DNP-9022-1型恒温培养箱。

1.2 培养基的配制

PDA固体培养基。马铃薯洗净、去皮、切成小块,称取200g,加1L蒸馏水,大火煮至沸腾后,改文火煮30min,八层纱布过滤,向滤液中加入20g葡萄糖,2.0gKH2PO4,1.0gMgSO4,15g琼脂,充分搅匀后定容至1000mL［5］。

PDA液体培养基Ⅰ。配方与配制方法同去除琼脂的PDA固体培养基。

PDA液体培养基Ⅱ。在PDA液体培养基I的基础上,每1000mL培养基添加100g木屑。

检测培养基。称取酵母浸出物10.0g,葡萄糖10.0g,琼脂20.0g,加蒸馏水600mL,加热使其充分溶解,再加亮蓝6.25g,用蒸馏水定容至1000mL。

所有培养基配制后,于0.1MPa、121℃灭菌20min,备用。

1.3 试验方法

1.3.1 菌种活化

将保藏菌株接入PDA斜面培养基,于28℃培养4d后转接1次,再于28℃培养7d,将其转接到PDA平板培养基上28℃培养7d,待用。

1.3.2 过氧化物酶的检测

在活化的菌种平板培养基和含亮蓝的培养基上分别打直径3mm的小孔,将含菌丝的菌塞接种于亮蓝培养基的小孔内,每个菌种3次,置28℃恒温培养,每隔24h观察亮蓝平板中接种菌落周围是否出现变色圈,以有无变色圈的出现判断是否有过氧化物酶的产生,有变色圈者记为“+”,反之则为“-”,并记录显色时间［6］。有变色圈出现的菌种分别在第7天测量菌丝圈（d1）和变色圈的直径（d2）。

1.3.3 粗酶液的制备

在经活化且有木质素过氧化物酶检出的菌种平板上,挑取适量菌丝分别接种于含250mLPDA液体培养基I和II的250mL三角瓶中,28℃静置培养1d后,于28℃、130r·min-1恒温摇床培养20d,第3天起,每天从培养液中吸取10mL发酵液单独保存。所有发酵液于3000r·min-1离心15min,上清液即粗酶液I和II,保存于冰箱中备用。

1.3.4 木质素过氧化物酶的检测

选取上述有变色圈出现的粗酶液I（培养7d）,于无菌条件下取3.5mL粗酶液,0.3mL 0.5mol·L-1的酒石酸钾钠缓冲液（pH值4.0）, 0.1mL1mmol·L-1的亚甲基蓝溶液混合,再向体系中加入0.1mL4.5mmol·L-1的H2O2启动反应。以灭活的粗酶液I（7d）反应体系作空白对照,若反应体系由淡蓝绿色转变为蓝紫色,则表明有木质素过氧化物酶产生,否则无木质素过氧化物酶产生［7］。有颜色变化者用“+”标记,无颜色变化者用“-”标记。

1.3.5 木质素过氧化物酶的酶活力测定

对不同培养时间的粗酶液样本进行酶活测定。在试管中加入2mL浓度为0.125mol·L-1的柠檬酸缓冲液（pH值为3.0）、1mL浓度为0.16mmol·L-1的天青B溶液、1mL粗酶液I, 30℃恒温水浴中保存5min后,向试管中再加入30℃2mmol·L-1H2O2溶液1mL启动反应,精确计时。测量反应在最初3min内在651nm处的吸光度（D）的减小速率,以每分钟每毫升粗酶液降低0.1个D值为1个酶活力单位［8-9］。每待测样品平行操作3次,取平均值。以相同的方法检测粗酶液Ⅱ中Lip酶活力。

2 结果与分析

2.1 过氧化物酶的检测

在含亮蓝的PDA平板培养基上接种3mm的菌丝,28℃下培养,每24h观察1次。结果（表1）17个菌株有15个样本培养基中出现变色圈。

表1 变色圈产生及菌丝圈和变色圈直径变化

2.2 Lip检测

将除TH4和TH33外的产生变色圈的菌株进行Lip检测,反应体系变色情况如表2所示。

表2 木质素过氧化物酶检测结果

2.3 Lip活力测定

利用天青B染料对分泌Lip的菌株进行酶活力测定。不同培养时间的发酵液滤液中Lip活力结果如图1所示。

图1 菌株不同培养时间的Lip活力变化

3 讨论与小结

3.1 过氧化物酶的检测

现阶段,常用一些特定的颜色反应来检测一个菌株是否具有降解木质素的能力,微生物若是能产生木质素降解酶尤其是过氧化物酶类,就能和培养基中的有效指示剂反应,产生特异的颜色变色圈,亮蓝是检测过氧化物酶的常用指示剂。在PDA培养基中添加适量亮蓝,在接种部位有过氧化物酶产生则会在其周围形成黄色的显色圈,并且酶活力的强弱和黄色圈的大小正相关。变色圈的形成有两种方式,一种是变色圈位于菌丝圈的内部,即d1＞d2（d1是菌丝圈直径,d2是变色圈直径）,另一种是变色圈在菌丝圈外部,即d1＜d2,二者是由于不同菌株间菌丝生长速度差异和分泌过氧化物酶能力的差异造成的［10］。

有研究表明,变色圈的实际面积的大小反映了酶对木质素降解能力的强弱,因此d2/d1可作为判定该微生物是否降解木质素的依据,如比值大于1,纤维素首先被降解；若比值小于1,则该微生物会首先选择性地降解木质素,且比值越小,越说明单位菌株可能产生酶的能力及酶活力越强［11］。从检测结果来看,待检的37株菌株中有35株都有变色圈产生,而在第7天在对产生变色圈的菌落分别测定菌丝圈和变色圈,并计算二者比值的结果显示,35株有过氧化物酶产生的菌株中,其d2/d1的值全部小于1,初步判断应会优先降解木质素。试验中,菌株TH6的d2/d1最小为0.062,表明该菌株可能降解木质素的能力最强。利用指示剂的变色圈反应,只是对氧化物酶的一种定性检测方法,而具体的酶活力须经过定量检测才能确定。

3.2 Lip的检测

亚甲基蓝是木质素降解酶的定性检测指示剂,在有过氧化氢启动反应的条件下,分泌Lip的菌株会使亚甲基蓝溶液的颜色由蓝绿色逐渐转变为蓝紫色。将初步判断有过氧化物酶产生的菌株进行Lip检测,检测结果表明,35株菌株中仅有2株菌株（TH11和TH20）有Lip产生,其余菌株分泌的过氧化物酶成分可能为Mnp或其他。

3.3 Lip活力测定

现阶段,对测定Lip活力的底物常用藜芦醇（Veratrylalcohol,VA）或天青染料。在采用藜芦醇作底物时,要使用pH为2.5的缓冲液,酶在此pH条件下容易失活,且该检测方法还对温度的稳定性有很高的要求,尤其是该法的检测波长为310 nm,微生物代谢产生的酚和苯类物质都会对紫外的吸收产生影响［12-13］。测定Lip的天青多为天青B,其稳定性高,生物反应条件下不易被脱色,专一性好,和Lac及MnP都不起反应；另外,该方法的检测波长为651nm,为可见光区,能够避免芳香化合物对检测的干扰,从而提高检测的灵敏度［14-15］。研究表明,一般在液体发酵第3天开始,陆续有胞外酶分泌,培养7～9d酶活力基本能达到峰值［16］,故试验在液体培养第3天开始进行活力测定,连续测定20d。测定结果显示,菌株TH11在第7天活力达到0.021U·mL-1,随后酶活力陡降；菌株TH20酶活随培养时间的延长而快速升高,第8天最高,达到0.035U·mL-1,随后也快速下降至接近无活性。而在培养基中添加木屑作为Lip的底物后,2个菌株达到最大酶活力的培养天数仍然是8d左右,但最大酶活力增加了3倍,分别达到0.057和0.096U·mL-1,且因为有底物的存在,酶活力在达到峰值后会在峰值保持2～3 d,而后因底物减少而缓慢下降,二者在培养20d后,仍有较低的酶活性。

试验对37株野生黑木耳菌株进行筛选,从中得到2株分泌Lip的菌株,其酶活力分别为0.021和0.035U·mL-1,活力水平较低,但为后续培育产高效及高活力Lip菌种奠定物质基础。

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（责任编辑：张瑞麟）

Q554.9

B

0528-9017（2014）02-0204-04

文献著录格式：于德涵,黎莉,苏适.产木质素过氧化物酶黑木耳菌株的筛选及酶活力的测定［J］.浙江农业科学,2014（2）：204-207.

2013-10-22

绥化学院科研项目（KQ1202008）

于德涵（1982-）,男,黑龙江绥化人,讲师,硕士,从事食用菌胞外酶及分子生物学的研究工作。E-mail：Yudehan @163.com。