猪防御素与六种抗生素联合使用的抑菌情况研究

■邹辉琴 温 静 康 健 李 钢

(四川华德生物工程有限公司，四川成都610013)

近些年来，畜产品中的抗生素药物残留问题越来越受到人们的重视，许多国家都出台了相应的政策来限制抗生素的添加，有的国家甚至禁止任何抗生素在饲料中的使用。此外，由于抗生素的使用不当,也造成了许多畜产品中耐药菌株的产生，并且其出现的频率已超过抗生素新药的开发速度,给疾病的治疗带来了很大的难度。因此，在畜产品生产中需要寻找一种新的途径来替代现有的传统生产方式。抗菌肽普遍存在于自然界的生物体中，是先天性免疫系统的重要组成成分，主要分布在黏膜、免疫细胞以及免疫器官等部位[1]。抗菌肽不仅具有广谱的杀菌作用，还具有稳定性好、水溶性好、抗菌机理独特、对高等动物正常细胞无害等特点[2]。关于抗菌肽和抗生素联合抑菌的报道虽然不多，但已经有一些相关报道证实了抗菌肽和抗生素之间存在协同抑菌效果[3]。本文利用改良的肉汤稀释法来判定猪防御素和六种抗生素之间联合抑菌试验效果，为药物合理使用问题提供了一个科学的参考依据。如果抗菌肽和抗生素的联合抑菌存在协同作用或累加作用，不仅能更好地提高用药效果，而且合理减少用药剂量以避免达到毒性剂量的危险，预防及延迟抗生素耐药性的发生，能更好地治疗混合性感染，这也为寻找新的用药方案提供了良好的铺垫。

1 材料和方法

1.1 试验样品

猪防御素：四川华德生物工程有限公司提供，其成分为抗菌肽；抗生素：硫酸黏杆菌素（colistin sulfate）、阿散酸（arsanilic acid）、替米考星（tilmicosin）、氟苯尼考（florfenicol）、盐酸多西环素（doxycycline hydrochloride）、阿莫西林（amoxicillin）全部购自于中国兽医药品监察所。

1.2 菌种及培养基

1.2.1 菌种

大肠埃希氏菌（Escherichia coli）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）均购置于中国工业微生物菌种保藏管理中心。

1.2.2 LB固体培养基

蛋白胨 10 g/l、酵母浸粉 5 g/l、NaCl 10 g/l、琼脂15 g/l，pH值自然，121℃条件下高压灭菌15 min。

1.2.3 LB液体培养基

蛋白胨10 g/l、酵母浸粉5 g/l、NaCl 10 g/l，pH值自然，121℃条件下高压灭菌15 min。

1.3 菌悬液的制备

分别将大肠埃希氏菌（Escherichia coli）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）划线菌接种至LB琼脂平板上，37℃培养24 h，挑取平板上的一个单菌落接种至30 ml（250 ml三角瓶）LB液体培养基中，37℃、200 r/min摇床培养16 h后备用。

1.4 主要仪器

高压蒸汽灭菌锅（上海申安LDZX-30KBS）、超净工作台（苏州净化SW-CJ-2FD）、可见分光光度计（上海佑科721）、恒温振荡培养器（上海苏坤SKY-200B）、隔水式培养箱（GNP-9080）、96孔酶标板。

1.5 试验方法

抗菌肽的制备：精确称取抗菌肽，配制成浓度为0.1 g/ml的溶液，在2 000 r/min下离心10 min，留上清液备用。

抗生素的制备：精确称取抗生素，用各自对应缓冲液将抗生素溶解配制成如表1对应浓度，在2 000 r/min下离心10 min，留上清液备用。

表1 抗生素配制情况

由于抗菌肽的自身结构的特殊性，所以试验在微量肉汤稀释法的基础上加以改进，这样能更准确地反应试验效果。试验前期先用微量稀释法把猪防御素和6种抗生素的MIC值找出来，然后确定每种药物的稀释度，每种药物最高浓度为其MIC的2倍，依次对倍系列稀释，应用改良的肉汤稀释法观测6种抗生素MIC的变化。该试验通过96孔酶标板作为细菌培养器皿，每排共有12孔，在每排的第1个孔和第9个孔加入270 μl含指示菌的LB营养液，剩余的孔全部加入含150 μl含指示菌的LB营养液。然后向每排的第一孔加入指定的样品溶液30 μl（单品15 μl+对应单品溶解缓冲液15 μl；单品15 μl+抗菌肽15 μl）。然后每排用吸头从第一个孔开始吹打混匀后依次向下面一个孔加入150 μl混合液，直到加入每排第8个孔后，吸取第8孔150 μl混合液废弃不要。每排的第9孔添加该排指定单品对应的溶解缓冲液（如表1所示）30 μl作为空白对照。待添加完成后将酶标板放入37℃恒温培养箱中培养16～18 h。第2 d取出酶标板，然后把所有孔中的混合液按照101～1066个稀释梯度涂板计数，最后算出混合液中指示菌含量。该试验最低抑菌浓度（MIC）定义为能抑制指示菌浓度对数约50%所对应的样品浓度值。FIC指数=A药联合时MIC/A药单测时MIC+B药联合时MIC/B药单测时MIC（判断标准：FIC指数≤0.5为协同作用；0.5＜FIC≤1为相加作用；1＜FIC≤2为无关作用；FIC＞2为拮抗作用。A药代表猪防御素，B药代表抗生素）[4-5]。

2 试验结果与分析

猪防御素与六种抗生素联合使用后对不同指示菌MIC的变化情况以及对应的FIC指数见表2。

由于硫酸黏杆菌素主要对革兰氏阴性菌存在抑菌作用，阿散酸、替米考星这两种抗生素主要对革兰氏阳性菌存在抑菌作用，所以试验中只有盐酸多西环素、氟苯尼考和阿莫西林同时做了革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抑菌试验。对于革兰氏阴性菌而言,从MIC的变化情况来看，该试验只有氟苯尼考和阿莫西林单独使用时或者与猪防御素联合其MIC没有任何变化，替米考星的MIC降低得最多，是原来的1/8倍，这些数据表明了猪防御素与六种抗生素的联合使用能提高大多数抗生素的抑菌效果。从不同指示菌角度来看，对于革兰氏阴性菌而言，抗生素联合使用时硫酸黏杆菌素、盐酸多西环素、氟苯尼考、阿莫西林的MIC分别为0.187 5、2.5、6.25、12 μg/ml，单独使用时硫酸黏杆菌素、盐酸多西环素、氟苯尼考、阿莫西林对应的MIC分别为0.75、10、6.25、12 μg/ml，通过FIC值的计算结果可以判断出猪防御素与硫酸黏杆菌素、盐酸多西环素存在协同抑菌效果，与氟苯尼考及阿莫西林联合抑制大肠埃希氏菌时存在无关作用。对于革兰氏阳性菌而言，猪防御素与盐酸多西环素、氟苯尼考、替米考星、阿散酸以及阿莫西林的联合使用所对应的MIC分别为0.125、3.125、6.25、25、15 μg/ml，这5种抗生素单独使用时MIC分别为0.25、6.25、50、100、30 μg/ml，通过计算FIC值可以判断出，猪防御素与阿散酸、替米考星具有协同抑制金黄色葡萄球菌的作用；此外，猪防御素与盐酸多西环素、氟苯尼考及阿莫西林具有累加抑菌效果。抗生素是通过破坏细菌细胞壁杀灭细菌的，抗菌肽是通过与细菌细胞壁结合，然后使细菌胞内物质溢出来杀灭细菌的，当抗菌肽和抗生素联合抑菌时，他们可能结合了各自的作用机理，使细菌更有效地被抑制或杀灭，该试验表明了猪防御素存在与抗生素联合使用的潜力。

表2 猪防御素与六种抗生素联合抑菌试验结果

3 讨论与展望

通过猪防御素与六种抗生素联合抑菌的总体试验结果分析可以看出，猪防御素的加入使盐酸多西环素、替米考星、氟苯尼考、阿散酸和阿莫西林的最低抑菌浓度都有不同程度的降低，间接表明了抗菌肽的加入使这几种某些抗生素的抑菌效果都提高了。本次研究表明了猪防御素和某些抗生素之间存在协同抑菌的作用，同时也体现出抗菌肽在配方饲料中的潜在应用价值。在本次试验研究的基础上，今后还需要付出更多的时间和精力去研究不同的抗生素与不同抗菌肽联合抑菌的相关机理，以及更进一步的动物体内、体外试验研究，为抗菌肽在新配方饲料方案中的大量使用奠定更加完善的试验基础。近年来有许多研究表明，抗菌肽的确对动物的常见致病菌具有强烈的抑制作用，并且对动物的生长性能也有促进作用。在养殖行业的疾病防御期间，如果在饲料中添加抗菌肽，能够避免致病菌产生耐药性，其使用效果稳定，属无毒副作用、无残留、无致细菌耐药性的一类环保型饲料添加剂[6-7]。在畜产品生产行业当中，尤其是在疾病治疗控制期间，如果让抗菌肽和抗生素混合合理使用，这样不仅能更好地提高用药效果，还可以降低因药物过度使用造成的经济损失，并且合理减少用药剂量以避免达到毒性剂量的危险，最重要的是利用抗菌肽和抗生素的合理搭配使用还可以预防及延迟抗生素耐药性的发生，能更好地治疗混合性感染。因此抗菌肽的确是寻找新的药物使用替代方案的理想候选。