A DA MT S-1与MMP-9蛋白在宫颈癌中表达情况的研究

杨 津

湖南省湘潭市妇幼保健院妇产科，湖南湘潭 411100

宫颈癌是目前全世界最常见的女性生殖道恶性肿瘤之一，其发病率仅次于乳腺癌。近年来发病率明显升高，且逐渐呈年轻化改变。其具体发病机制尚未完全清楚，与HPV感染高度相关[1]。最新研究表明：基质金属蛋白酶(MMPs)的活性与癌症的侵袭转移能力密切相关。其中MMP-9可能参与人类宫颈癌的发生及转移过程[2-3]。

I型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶（A Disintegrin and Metallo-proteinase with Thrombospondin motifs，ADAMTS）家族是一类具有金属蛋白酶（MMP）特性的蛋白质[4]。目前，国内外学者对其与肿瘤发生发展的关系研究较少。其中，ADAMTS-1参与多种炎症损伤反应或血管修复过程，在多种炎性疾病尤其是前列腺癌的发生发展中发挥重要作用[5]。本研究应用免疫印迹法（Western blot）检测人类宫颈癌组织的ADAMTS-1、MMP-9蛋白表达情况，为该病的发生、侵袭转移机制提供新的线索。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本组患者均为女性。收集本院2008年1月—2012年9月妇科收治的宫颈癌标本（实验组）37例，年龄 36～64岁，平均年龄(49.3±3.2)岁；术后发现盆腔淋巴结转移者2例（5.4%）。26例高级别宫颈上皮内瘤变 （CINⅡ-Ⅲ级）标本取自宫颈利普刀切除患者，年龄 28～46岁，平均年龄(38.4±4.6)岁。10例正常宫颈（对照组）样本取自行子宫肌瘤术切除全子宫的患者，年龄32～75岁，平均年龄(52.5±2.6)岁。

1.2 主要仪器与试剂

聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）试剂盒与western blot电泳槽、电泳仪、预染蛋白Marker、loading buffer、化学发光液等由本院中心实验室提供。RIPA蛋白提取裂解液与蛋白定量试剂盒均购自大连宝生物技术有限公司。兔单克隆ADAMTS-1抗体、鼠单克隆MMP-9抗体、山羊抗兔、抗鼠二抗、内参GAPDH抗体均购自中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 免疫印迹法（Western blot）检测

收集新鲜宫颈癌、宫颈上皮内瘤变与正常宫颈组织标本与EP管中。按照一定比例加入RIPA裂解液提取总蛋白。在4℃环境中操作提取总蛋白，采用智能温控离心机进行高速离心时。遵照BCA法准确测量测定各组标本中蛋白浓度后，加入loading buffer于沸水煮样，多余蛋白液立即置入-80℃冰箱冻存备用。于电泳操作前45 min制备10%SDS-PAGE分离胶，然后配制浓缩胶。每泳道上样量60 mg蛋白。等待样品蛋白跑到合适位置后将蛋白转移到PVDF膜上。凝胶电泳时电压80 V～120 V恒压，1.5～2.0 h，转印时电压45V，2.0 h。转印完毕后，将PVDF膜上的蛋白进行封闭、一抗4℃冰箱孵育过夜、二抗室温孵育2.5 h。完毕后，将PVDF膜充分洗涤后，加入plus-ECL化学发光试剂显影照相。

1.4 结果计算与统计分析

各组标本ADAMTS-1、MMP-9蛋白的相对表达量为其灰度值/GAPDH灰度值。应用SPSS 19.0统计软件，方差分析或t检验用于比较各组标本两种蛋白的相对表达量，P＜0.05且在95%可信区间（Confidence Index，CI）表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组标本ADAMTS-1、MMP-9蛋白的相对表达量

本组宫颈癌、CINⅡ-Ⅲ级、对照组患者分别为37例、26例、11例。其ADAMTS-1蛋白相对表达量分别为：0.0307±0.0054（0.0289～0.0325）、0.0149±0.0037（0.0133～0.0164）、0.4613±0.08185（0.4063～0.5163）（图 1）。三组标本中，MMP-9 蛋白相对表达量分别为 ：0.4642±0.0918 （0.4335～0.4948）、0.1456±0.0520 （0.1246～0.1666）、0.0164±0.0057（0.0126～0.0203）（图 2）。

图1 各组标本ADAMTS-1蛋白的相对表达量

图2 各组标本MMP-9蛋白的相对表达量

2.2 统计分析

两组比较的方差分析显示各组标本ADAMTS-1、MMP-9蛋白的表达差异情况。LSD检验结果显示：宫颈癌标本中ADAMTS-1蛋白的表达量明显高于高级别上皮内瘤变组织 （F=0.016，P=0.050；95%CI：0.0001～0.0316），然而其表达量明显低于与对照组（F=-0.4306，P＜0.001；95%CI：-0.4518～-0.4093）。宫颈癌标本中MMP-9蛋白的表达量明显高于高级别上皮内瘤变组织 （F=0.3185，P＜0.001；95%CI：0.2816～0.3554） 与对照组 （F=0.4477，P＜0.001；95%CI：0.3981～0.4973）。高级别上皮内瘤变组织标本中MMP-9蛋白的表达量明显高于对照组 （F=0.1291，P＜0.001；95%CI：0.0772～0.1811）。非参数相关性检验（Kendall、Spearman检验）结果均显示：人类宫颈癌组织中ADAMTS-1与MMP-9蛋白的相对表达量呈负相关（P均＜0.05）（表1），而宫颈上皮内瘤变与正常宫颈组织标本中ADAMTS-1与MMP-9蛋白的相对表达量在无显著地相关性（P 均>0.05）。

表1 非参数相关性检验（Kendall、Spearman）显示宫颈癌中ADAMTS-1与MMP-9表达的相关性

3 讨论

ADAMTS蛋白家族广泛存在于哺乳动物中，是能够溶解细胞外基质的蛋白质。有19个家族成员，结构与MMP蛋白酶类似，有Zn2+结合位点。每个成员在不同年龄段、不同组织中表达有明显差异[6-7]。例如：成人的脑、神经、前列腺等组织均表达ADAMTS-13、17、18；而胚胎时期的肾脏、肺组织均主要表达 ADAMTS-14、16、17、18 等，肝脏组织主要表达 ADAMTS-13、15、18[8-9]。与 MMP蛋白家族相比，目前国内学者对ADAMTS的结构与功能研究较少。

ADAMTS-1属于分泌型蛋白,是目前研究较多的一个成员。其位于21号染色体长臂21～22，编码951个氨基酸，分子量为100kd左右。最早在小鼠结肠腺癌基因差异表达的研究中被发现[10-11]。ADAMTS-1有多个结构域，其中血小板凝血酶敏感蛋白样序列区（TSP）被认为是其主要功能区域。ADAMTS-1通过C末端3个TSP重复序列和间隔区锚定在细胞外基质中，可通过aggrecan、Versican、brevican等蛋白来发挥降解细胞外基质蛋白的作用。人为干扰ADAMTS1的表达，可导致小鼠中TSP表达下降，进而引起组织血管增多、延长伤口愈合时间[12-13]。

肿瘤的发生是一个多步骤、多基因突变的过程。已证实，宫颈癌的发生可能与多种基因如 HDAC1、DNMT1、RECK、P53、P2X7、MMP-9等基因突变及炎症相关蛋白表达异常有关[16]。部分研究表明：ADAMTS-1参与多种炎症损伤反应或血管修复过程与肿瘤的发生发展过程。C.Mastronard等研究发现：IL-1β、IL-1可上调ADAMTS-1的表达，而TGF-β1则抑制其过度表达，从而维持炎症损伤反应的平衡。ADAMTS-1可通过降低VEGF的过表达进而抑制血管再生修复功能[14-15]。本组共74例标本，免疫印迹检测发现，慢性宫颈炎组标本中ADAMTS-1呈高表达状态，提示ADAMTS-1直接参与慢性宫颈损伤与炎症修复的重要功能。然而，其在高级别上皮内瘤变、浸润性癌组织的表达量明显降低（P均＜0.001），提示ADAMTS-1有抑制肿瘤发生的作用。然而，肿瘤组织中其表达下调机制目前尚未明确。

MMP-9蛋白在人类宫颈癌组织与Hela细胞中表达明显增强，并与癌症的侵袭、转移有关[2-3]。然而，其在宫颈高级别上皮内瘤变组织的表达却尚未清楚。本组高级别上皮内瘤变组织标本中MMP-9蛋白的表达量明显于高对照组（P＜0.001）。这一结果进一步证实MMP-9蛋白与宫颈癌的发生相关。然而，其表达量明显低于浸润性宫颈癌组织，提示着MMP-9的确参与癌症的侵袭、转移过程（P＜0.001）。

血管的长入是癌组织生长最关键因素，其主要步骤包括：血管内皮细胞的增值与迁移、毛细血管基底膜降解以及基底膜等再生等[17]。目前，越来越多的学者意识到：MMP与ADAMTS蛋白家族存在相互交联，然而其具体机制尚未阐明。一些皮肤损伤的研究发现：ADAMTS-1、MMP-2与FGF-2存在相互调节作用。上调ADAMTS-1的表达可促进FGF-2的高表达，进而促进成纤维细胞的聚集和迁移[18]。这一现象可能与ADAMTS-1促进MMP-2的高表达相关。此外，J.Kim等研究发现：动脉粥样硬化中ADAMTS-1高表达，基因敲除ApoE表达的转ADAMTS-1基因小鼠的血管内膜较ApoE正常表达的内膜明显增厚[19]。

本研究采用Kendall、Spearman等非参数相关性检验，进一步显示人类宫颈癌组织中ADAMTS-1与MMP-9蛋白的相对表达量呈负相关（P均＜0.05），而宫颈上皮内瘤变与正常宫颈组织标本中ADAMTS-1与MMP-9蛋白的相对表达量在无显著地相关性（P均>0.05）。这一结果提示：宫颈癌组织中ADAMTS-1的低表达引起肿瘤组织的血管生长失衡，炎性介质（MMP-9蛋白）释放增加，进而促进肿瘤的发生、发展。然而，ADAMTS-1与MMP-9蛋白的具体作用机制尚需进一步深入的研究来阐明。

与本研究类似，其他学者在乳腺癌、肝癌中研究发现：ADAMTS-1可能参与癌症的侵袭转移过程。ADAMTS-1低表达或缺失的肿瘤组织中，其肿瘤体积、血管数目与坏死度明显大于ADAMTS-1阳性组织。ADAMTS-1的上调能明显抑制肾、结肠组织的转移性肝癌的生长[20-21]。相反，最近研究结果显示：ADAMTS-1对癌症的转移具有促进作用，主要机制是ADAMTS-1促进可ECM中信号蛋白3C的释放与膜相关磷酸化肝素多聚蛋白-4的脱落，引起细胞黏附力减弱、进而促进癌症转移[22-23]。本组病例中，盆腔淋巴结转移者所占比例太少（仅5.4%），无法做出有意义的统计。因而，本研究尚未发现ADAMTS-1与宫颈癌预后有显著相关性。

4 小结

综上所述，本研究初步检测了宫颈癌组织中ADAMTS-1与MMP-9蛋白表达情况。结果显示：宫颈癌中ADAMTS-1表达量明显下调、MMP-9蛋白表达量明显上调。宫颈癌中ADAMTS-1与MMP-9蛋白的相对表达量呈负相关，两者在宫颈上皮内瘤变与正常宫颈组织中的表达无显著地相关性。这一现象提示：ADAMTS-1可能与宫颈癌中的发生有关，且可能通过上调MMP-9蛋白的表达途径实现；为ADAMTS蛋白的深入研究打下了基础。然而，本研究的主要缺点在于实验样本太少、研究方法单一，更多可靠结论尚需更多研究来证实。

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