盐酸埃克替尼对ACC-M细胞MMP-2、E-cadherin蛋白表达的影响

杨彩玲，韩金红，王伟新，崔卫刚*

(1.新乡医学院第一附属医院口腔外科，河南卫辉453100;2.新乡医学院基础医学院，河南新乡453003)

0 引言

盐酸埃克替尼是我国自主研发的第一种表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂，可抑制人表皮细胞癌、胃腺癌细胞的生长增殖［1-2］，它能通过负性调控AKT信号通路抑制非小细胞肺癌的生长［3］，在体外可抑制人舌鳞癌Tca8113细胞的生长、增殖［4-5］，但是它对人涎腺腺样囊性癌ACC-M细胞的作用如何，还未见相关研究报道.笔者拟通过体外研究，探讨该抑制剂对体外培养的人涎腺腺样囊性癌ACC-M细胞MMP-2、E-cadherin蛋白表达的影响，探讨其是否可抑制ACC-M细胞的浸润、转移.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

细胞培养箱(美国，Forma公司)，流式细胞仪(德国，Partec公司).人癌细胞株ACC-M(人涎腺腺样囊性癌细胞，上海，上海交通大学口腔医学院)，盐酸埃克替尼(杭州，浙江贝达药业有限公司)，RPMI1640培养基(美国，Gibco公司)，新生小牛血清(杭州，杭州四季青生物工程材料公司)，MMP-2、E-cadherin(美国，Santa Cruz公司)，通用型S-P超敏试剂盒、DAB试剂盒(北京，北京中杉金桥生物技术公司).

1.2 实验方法

1)细胞培养:人涎腺腺样囊性癌ACC-M细胞，将含有1.0×105U·L-1链霉素、1.0×105U·L-1青霉素，以及含10%小牛血清的RPMI-1640培养基，放在温度为37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养，每2 d换1次培养液，当细胞贴壁生长密度达到80%左右时，传代.

2)免疫细胞化学检测:在6孔培养板内进行细胞爬片，当细胞生长后的密度大于1.0×108个·L-1时，按照0μmol·L-1和20μmol·L-1的浓度配制盐酸埃克替尼溶液，分别加入相应标记孔中，放在37℃、5%CO2的恒温培养箱内培养48 h.MMP-2与E-cadherin蛋白一抗工作液浓度均为1∶100，在阴性对照组里，用PBS液代替一抗工作液.严格按照说明书的染色步骤进行染色，并在光镜下观察结果:MMP-2蛋白与E-cadherin蛋白的阳性结果均表现为细胞质着棕黄色颗粒，它们的阴性结果均表现为不着色.

3)流式细胞仪检测:在培养瓶中进行细胞的平行接种，当细胞生长后的密度大于1.0×108个·L-1时，按照0μmol·L-1、20 μmol·L-1的浓度配制盐酸埃克替尼溶液，分别加入相应培养瓶中，使每1个培养瓶中抑制剂的作用时间达到48 h，收集细胞，加入-20℃的75%乙醇固定细胞.取单细胞悬液1.0×106个·L-1，加入鼠抗人单克隆抗体工作液0.1mL(MMP-21∶100;E-cadherin 1∶100)，采用室温孵育，30min后进行PBS洗涤，加入100μL羊抗鼠FITCIgG二抗工作液，采用避光室温孵育，30min后再进行PBS洗涤，加入0.1mL的PBS进行500目铜网的过滤后，上机检测.蛋白表达定量分析用Fi(荧光指数)表示，当 Fi＞1.0时，结果为阳性表达;当Fi≤1.0时，结果为阴性表达.实验重复3次.

4)统计:应用SPSS13.0软件进行统计学处理，实验数据以表示，采用析因设计方差分析，检验水准α=0.05.

2 结果

2.1 免疫细胞化学染色

免疫化学染色表明:盐酸埃克替尼作用ACC-M细胞后，MMP-2蛋白与E-cadherin蛋白的表达均发生变化.与参照组相对比，MMP-2蛋白细胞胞质染色阳性率明显降低(见图1);E-cadherin蛋白细胞胞质染色阳性率明显增加(见图2).

图1 MMP-2蛋白的表达(SP，×400)

图2 E-cadherin蛋白的表达(SP，×400)

2.2 间接免疫荧光流式定量检测

间接免疫荧光流式定量检测结果表明:0 μmol·L-1盐酸埃克替尼作用ACC-M细胞48 h后，MMP-2蛋白的XMode值为7.4±0.58，E-cadherin的 XMode值为7.9 ±0.64.20 μmol·L-1盐酸埃克替尼作用ACC-M细胞48 h后，MMP-2蛋白与E-cadherin蛋白的表达均发生变化.MMP-2蛋白的XMode值为5.7±0.43，E-cadherin的XMode值为 8.6 ±0.71.根据 XMode值计算蛋白的FI值:MMP-2蛋白的FI值为0.967±0.001，E-cadherin蛋白的FI值为1.011±0.001.MMP-2蛋白呈阴性表达，E-cadherin蛋白呈阳性表达.

3 讨论

细胞外基质和基底膜对维持细胞外基质蛋白结构的稳定起着极其重要的作用.细胞间同质粘附力下降，或者细胞对细胞外基质的异质粘附力升高，均可导致肿瘤侵袭转移的发生.证明基质金属蛋白酶几乎能降解细胞外基质的各种蛋白成分，在肿瘤细胞的浸润转移中具有关键性作用，其家族成员MMP-2由于定位于细胞穿透基质的突出部位，故最易和肿瘤细胞的侵袭生长发生关联［6］.据相关实验显示，它在ACC-M(肺高转移细胞株)中的表达高于ACC-2，表明ACC-M的肺高转移能力可能与MMP-2的高表达有关［7］.本实验用20 μmol·L-1盐酸埃克替尼作用MMP-2蛋白48 h，并分别对其进行免疫细胞化学检测和流式细胞仪检测，结果显示，埃克替尼作用后，MMP-2蛋白表达降低，呈现阴性表达.

E-cadherin是一种钙依赖性跨膜糖蛋白，可通过细胞接触抑制阻碍肿瘤细胞的去分化与恶性增殖，还可通过保持细胞黏附性，抑制肿瘤细胞的浸润或转移.E-cadherin蛋白在人类的许多肿瘤中如肺癌、口腔鳞状细胞癌等表达异常［8-9］，表现为不表达或异位表达，表达强度与恶性肿瘤的组织分级呈负相关［9-10］.E-cadherin蛋白的表达可以预测酪氨酸激酶抑制剂的敏感性和临床疗效［11-12］.本实验用20 μmol·L-1盐酸埃克替尼作用 E-cadherin 蛋白48 h，并分别对其进行免疫细胞化学检测和流式细胞仪检测，结果显示，盐酸埃克替尼作用后，E-cadherin蛋白表达增高，呈现阳性表达.

综上所述，盐酸埃克替尼通过降低MMP-2蛋白的含量，增加E-cadherin蛋白的含量，可能抑制肿瘤的侵袭、转移，但关于其中更深入的作用机制尚需进一步的深入研究.

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