基于N-羧甲基壳聚糖钆基磁共振造影剂的制备及性能

2014-01-18张长丽顾费晨陈昌云陆国飞蔡雯希

无机化学学报 2014年12期

张长丽顾费晨陈昌云陆国飞蔡雯希

(1南京晓庄学院生物化工与环境工程学院，南京 211171)

(2南京大学配位化学国家重点实验室，南京 210093)

磁共振成像 (Magnetic resonance imaging，MRI)具有安全、快速及高分辨率显示不同组织的精细对比等特点，广泛用于医学诊断领域[1-4]。磁共振造影剂是磁共振成像的重要辅助工具，可提高成像质量并扩展诊断范围[5]。目前临床所用造影剂主要为钆基配合物(如Gd-DTPA，Gd-DOTA)，这类造影剂具有稳定性高、水溶性好及渗透压低等优点[6]，但其在体内停留时间短、易解离、弛豫率较低[7]。配体分子量的增加有助于配合物弛豫率的提高[8]。壳聚糖(CS)是来源广泛的天然大分子，生物相容性好，壳聚糖经羧甲基化反应后生成的一类壳聚糖衍生物称为羧甲基壳聚糖(carboxymethyl chitosan，CMCS)。羧基的引入使羧甲基壳聚糖的水溶性和金属离子结合能力大大提高，其中N-羧甲基壳聚糖(NCMCS)可作为一种性能优良的造影剂成分[9]。

Scheme 1 化合物DTPAA、DTPA-CS及DTPA-NCMCS的合成路线Scheme 1 Synthesis of compounds DTPAA,DTPA-CS and DTPA-NCMCS

本文将NCMCS与DTPA共价链接形成新配体，不仅DTPA对Gd（Ⅲ）具有很强配位能力，壳聚糖主链糖环侧面大量的羟基和氨基也可能会对Gd（Ⅲ）形成附加配位作用[10]，使该金属配合物在近生理条件下具有良好的稳定性。另外，聚合壳聚糖在水中以缠绕团聚的分子构象存在[11]，这更有利于防止金属离子外泄，从而实现降低毒性的目的。此外，引入较大分子量的NCMCS可增加配合物的分子量，从而增加配合物的弛豫性能。

本文用红外光谱对合成的配体及配合物Gd-(DTPA-NCMCS)和 Gd-(DTPA-CS)进行了表征，用电感耦合等离子体质谱仪 (ICP-MS)分析了配合物中Gd（Ⅲ）的含量。进而研究了配合物的生物相容性和纵向弛豫性能，初步探讨了其作为潜在磁共振成像造影剂的应用价值，为扩展N-羧甲基壳聚糖在磁共振成像领域中的应用提供了实验依据。

1 实验部分

1.1 实验试剂及仪器

壳聚糖(CS，脱乙酰度不低于95%，粘度100～200 mPa·s)及羧甲基壳聚糖(NCMCS，10～1 000 mPa·s)均来自阿拉丁公司，合成中常用试剂和溶剂均为国内商业试剂。细胞实验中所用的各类无机盐均为Aldrich或Alfa的分析纯试剂，水为经MILIPORE处理的超纯水。红外光谱表征由BRUKERVECTOR22傅立叶变换红外光谱仪完成，配合物弛豫时间测试在SIEMENS公司Trio 3T磁共振成像设备上完成的，图像处理软件为Image J。配合物中Gd（Ⅲ）含量与细胞内Gd（Ⅲ）浓度的测定在Thermo公司的X SeriesⅡ电感耦合等离子体质谱仪上完成。

1.2 配合物Gd-(DTPA-NCMCS)、Gd-(DTPA-CS)和Gd-DTPA的合成

1.2.1 二乙三胺五乙酸二环酸酐(DTPAA)的合成[12]

称取 3.93 g(10 mmol，1 equiv.)DTPA悬浮于3.78 mL乙酸酐(40 mmol，4 equiv.)和 5 mL吡啶(60 mmol，6 equiv.)混合反应液中，搅拌回流 1 h，抽虑，分别用乙酸酐和无水乙醚洗3～5次，40℃下真空干燥至恒重，得白色粉末2.81 g，产率为78.5%。

1.2.2 DTPA-CS的合成[13]

称取5.0 g壳聚糖(31 mmol氨基葡萄糖单元)溶于100 mL含10%醋酸的水溶液中，加入400 mL甲醇，再加入46.0 g(117 mmol)DTPAA，室温搅拌24 h。抽滤，沉淀和乙醇混合继续搅拌12 h。再抽滤，沉淀与pH值为11的NaOH溶液混合搅拌12 h。抽滤，沉淀用超纯水反复洗涤，直到洗液呈中性。用无水乙醇重结晶，真空干燥，得白色固体6.2 g。

DTPA-NCMCS的合成方法同DTPA-CS，DTPANCMCS产物为黄色固体。

1.2.3 Gd-(DTPA-CS)配合物的合成[13]

称取 0.45 g(1 mmol，1 equiv.)的 Gd(NO3)3·6H2O溶于5 mL含1%醋酸的水溶液中，称取0.24 g的DTPA-CS溶于另外5 mL含1%醋酸的水溶液中。将两种溶液混合，60℃搅拌24 h。浓缩反应液，加入一定量的无水乙醇，搅拌10 min后抽滤，用无水乙醇洗涤3次，真空干燥，得0.26 g棕色固体。

配合物Gd-(DTPA-NCMCS)的合成方法同配合物 Gd-(DTPA-CS)，配合物Gd-(DTPA-NCMCS)也为棕色固体。

1.2.4 Gd-DTPA的合成[14]

称取 4.51 g(10 mmol，1 equiv.) 的 Gd(NO3)3·6H2O溶于10 mL蒸馏水中。称取4.13 g(10.5 mmol，1.05 equiv.)的 DTPA溶于 25 mL水中，滴加 2 mol·L-1的NaOH溶液使其溶解。将DTPA溶液滴加到硝酸钆溶液中，用2 mol·L-1的NaOH溶液调节反应液的pH值至6.8，80℃反应12 h。将反应液浓缩，加入适量的乙醇，析出固体，抽滤，用乙醇洗涤，真空干燥，即得白色固体Gd-DTPA，产率为82%。

1.3 配合物中Gd（Ⅲ）含量的测定

准确称取一定质量的配合物Gd-(DTPANCMCS)、Gd-(DTPA-CS)和 Gd-DTPA；加入高纯浓硝酸室温消解48 h，再加入质量分数为30%的H2O2室温反应4 h，定容(硝酸的含量小于1%)，用ICPMS检测Gd（Ⅲ）的含量。

1.4 体外配合物稳定性测定[15]

配制 Gd（Ⅲ）的浓度为 2 mmol·L-1配合物 Gd-(DTPA-NCMCS)、Gd-(DTPA-CS)和 Gd-DTPA 溶液(含1%醋酸，0.9%NaCl水溶液)；分别加入 Na2C2O4，终浓度为 20 mmol·L-1；混匀，37 ℃孵育 24 h；离心，取上清；加入高纯浓硝酸室温消解48 h，再加入质量分数为30%的H2O2室温消解4 h，定容；用ICP-MS检测溶液中Gd（Ⅲ）的含量。

1.5 体外驰豫性能研究

1.5.1 纵向弛豫率(r1)的测定

分别配制一系列不同浓度的配合物的水溶液，浓度分别为 0.0，0.4，0.8，1.2，1.6 和 2.0 mmoI·L-1。弛豫时间T1通过核磁共振与成像分析仪 (imaging&analyzing system)中的反转恢复系列(inversionrecovery sequence)测得(32 ℃，3 T)。 r1(L·mmol-1·s-1)根据式：(1/T1)溶液=(1/T1)水+r1cM得到，cM为溶液中Gd（Ⅲ）的物质的量浓度(mmol·L-1)。

1.5.2 体外T1加权成像

体外T1加权成像通过成像分析仪 (imaging&analyzing system)中的多层自旋回波序列(Multiple spin echo sequence；MSE)测得，参数设置如下：重复时间TR=6000 ms，回波时间TE=7.2 ms，扫描次数NS=12，层厚 Slice thickness=2.5 mm。将 2.0 mmol·L-1的配合物和作为对照的Gd-DTPA水溶液稀释成浓度分别为 0.0，0.5，1.0，1.5 和 2.0 mmol·L-1浓度的溶液。体外T1加权成像信号值通过Image J软件进行分析。

1.6 细胞毒活性测定

按照1×106cm-2的密度将HeLa细胞悬液接种于96孔板中，然后置37℃，5%CO2的培养箱中培养。当细胞处于对数生长期，加入浓度梯度分别为：0.5，5.0，10.0，20.0，40.0，80.0 μmoI·L-1的化合物。继续培养48 h，加入浓度为5 g·L-1的噻唑蓝(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT)20 μL，37 ℃孵育 4 h，弃去上清，加入150 μL 二甲亚砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)，震荡10 min，用酶标仪测570 nm处溶液的吸光度。

1.7 细胞的摄取

MCF-7细胞用含10%胎牛血清 (Fetal Calf Serum，FBS) 的高糖 DMEM(Dulbecco′s Modified Eagle Medium)培养基培养，按照密度 1×106cm-2接种于六孔板中，细胞处于对数生长期时，加入浓度为2 mmol·L-1不同配合物溶液 150 μL，使 Gd（Ⅲ）的浓度为 100 μmol·L-1。37 ℃，5%CO2的条件培养16 h。

细胞用胰酶消化液(0.25%，含0.02%EDTA)消化，用1×PBS缓冲液洗涤2次，弃去上清，得细胞沉淀，加入高纯浓硝酸40 μL室温消解48 h，再加入质量分数为30%的H2O240 μL室温消解4 h，定容至1.5 mL，用ICP-MS检测Gd（Ⅲ）的含量。

2 实验结果

2.1 红外光谱分析

NCMCS、DTPA-NCMCS 及 Gd-(DTPA-NCMCS)的红外光谱图如图1所示。对比NCMCS与DTPANCMCS的图谱，大多数吸收峰基本相似；DTPANCMCS图谱中1 734 cm-1出现了羧酸根中羰基的伸缩振动峰，表明DTPA已被键合到NCMCS上。Gd-(DTPA-NCMCS)图谱中 1 624 cm-1及 1 402 cm-1的吸收峰分别移到1 601 cm-1和1 384 cm-1处，说明DTPA-NCMCS与Gd（Ⅲ）形成了配位键。

图1 原料NCMCS、配体DTPA-NCMCS及配合物Gd-(DTPA-NCMCS)的红外光谱图Fig.1 FTIR spectra of NCMCS,DTPA-NCMCS and Gd-(DTPA-NCMCS)

图2为一组与CS相关的红外谱图，DTPA-CS图谱中羧酸根中羰基的伸缩振动峰在1 734 cm-1处，形成Gd-(DTPA-CS)配合物后，1 624 cm-1及1 402 cm-1的吸收峰分别移到1 594 cm-1和1 384 cm-1处。

图2 原料CS、DTPA-CS及配合物Gd-(DTPA-CS)的红外光谱图Fig.2 FTIR spectra of CS,DTPA-CS and Gd-(DTPA-CS)

2.2 配合物中Gd（Ⅲ）含量的测定

用ICP-MS法测得配合物Gd-(DTPA-CS)中钆的含量达到22.38%，羧甲基壳聚糖配合物中配合物Gd-(DTPA-NCMCS)中钆的含量为12.83%。表明配合物Gd-(DTPA-NCMCS)中配体所占比例比配合物Gd-(DTPA-CS)中配体所占比例高，我们期望配合物分子量的增加会引起配合物纵向弛豫率的增加。

2.3 体外配合物稳定性测定

草酸钆极难溶，被广泛用于钆元素的萃取[16]。因此，我们将Na2C2O4与配合物Gd-(DTPA-NCMCS)、Gd-(DTPA-CS)和Gd-DTPA在37℃孵育24 h后用ICP-MS测定配合物 Gd-(DTPA-NCMCS)、Gd-(DTPACS)和Gd-DTPA中Gd（Ⅲ）的浓度，发现其比反应前分别降低了(6.2±1.2)%，(6.8±1.8)%和(5.4±1.7)%。表明配合物Gd-(DTPA-NCMCS)在近生理条件下具有较大的稳定性，可以进一步用于体内磁共振造影应用。

2.4 体外驰豫性能

2.4.1 纵向弛豫率(r1)的测定

弛豫率用来评价不同造影剂的信号增强能力，顺磁性造影剂的质子弛豫性能通常通过纵向弛豫率r1来评价。配合物溶液的弛豫时间的倒数T1-1(s-1)与浓度(mmol·L-1)的线性关系如图3所示，相关系数为0.999，表明两者有很高的相关性。

图3 配合物 Gd-(DTPA-NCMCS)、Gd-(DTPA-CS)及Gd-DTPA的T1-1与浓度之间的线性关系Fig.3 T1-1of Gd-(DTPA-NCMCS),Gd-(DTPA-CS)and Gd-DTPA vs the concentrations of the complexes

通过1.5.1中公式计算得到配合物Gd-(DTPANCMCS)、Gd-(DTPA-CS)和Gd-DTPA在水溶液中的纵向弛豫率r1，结果列于表1。从表中可以看出，Gd-(DTPA-NCMCS) 在水溶液中的 r1是 7.06 L·mmol-1·s-1Gd-(DTPA-CS)在水溶液中的 r1是 4.56 L·mmol-1·s-1，而 Gd-DTPA在水溶液中的 r1只有 3.01 L·mmol-1·s-1。从实验结果可以看出，配合物Gd-(DTPA-NCMCS)及Gd-(DTPA-CS)的r1值均高于商业化的MRI造影剂Gd-DTPA。根据文献报导[17-18]，引起弛豫率增加的原因一般有如下几种：(a)其他结构的引入增加了相对分子量，降低了分子的相关旋转速率；(b)内层配位水分子的增加；(c)外层配位水分子的增加。配合物弛豫率的提高主要是由第一种因素引起的，因为-COOH向-CONH-或-COO-的转变一般不会引起内层和外层水分子数目的变化。且配合物 Gd-(DTPA-NCMCS)和 Gd-(DTPA-NCMCS)的结构相似，分子量大的Gd-(DTPA-NCMCS)纵向弛豫率r1更大。

表1 配合物Gd-(DTPA-NCMCS)、Gd-(DTPA-CS)及Gd-DTPA在水溶液中的纵向弛豫率r1Table 1 Longitudinal relaxation rate(r1)of Gd-(DTPA-NCMCS),Gd-(DTPA-CS)and Gd-DTPA in aqueous solution

2.4.2 体外T1加权成像

钆基功能配合物的体外T1加权成像效果通过不同浓度的图像来表现。从图中可以看出，随配合物溶液浓度的增加，其体外成像的亮度逐渐增强。相同浓度下，Gd-(DTPA-NCMCS)与 Gd-(DTPA-CS)成像的亮度均大于Gd-DTPA，表明壳聚糖结构的引入大大降低了分子的相关旋转速率，提高了造影剂的弛豫率和成像信号强度。在浓度为2.0 mmol·L-1时，配合物Gd-(DTPA-NCMCS)成像亮度最强。换言之，要达到Gd-DTPA同等的成像亮度和对比度，使用配合物Gd-(DTPA-NCMCS)作为造影剂可以降低配合物用量，从而可提高其体内安全性。

图4 配合物 Gd-(DTPA-NCMCS)、Gd-(DTPA-CS)及 Gd-DTPA在不同浓度条件下体外T1加权成像图Fig.4 T1-weighted images in vitro vs concentrations of Gd-(DTPA-NCMCS),Gd-(DTPA-CS)and Gd-DTPA

2.5 配合物的生物相容性

进一步考察配合物的生物相容性，采用MTT法研究配合物对细胞的毒性。以HeLa细胞为作用对象。通过不同浓度的配合物作用于细胞，得到不同浓度下配合物对细胞的抑制率见表2，柱状图如图5，拟合得到配合物Gd-(DTPA-CS)和Gd-(DTPANCMCS)的 IC50值(表)分别为 308.6 和 568.2 μmol·L-1。两种配合物的IC50值均很大，表明这两种配合物的毒性很低，可以作为潜在的磁共振造影剂。

图5 配合物 Gd-(DTPA-CS)和 Gd-(DTPA-NCMCS)对HeLa细胞的毒活性(48 h)Fig.5 Cytotoxicity against HeLa cells of Gd-(DTPANCMCS)determined by MTT assay after 48 h

表2 配合物Gd-(DTPA-CS)和Gd-(DTPA-NCMCS)对HeLa细胞作用的IC50值Table 2 IC50against HeLa cells of Gd-(DTPA-CS)and Gd-(DTPA-NCMCS)

本实验用ICP-MS测定了HeLa细胞中Gd的含量(表3)，结果说明修饰了壳聚糖和N-羧甲基壳聚糖的Gd-DTPA配合物进入细胞的量均比Gd-DTPA进入细胞的量多，尤其是Gd-(DTPA-NCMCS)进入细胞的量最多，达到 17.8 μg·L-1。结果表明，达到相同的造影效果，配合物Gd-(DTPA-NCMCS)的使用量最低，从而可减少造影剂的毒性。

表3 用ICP-MS测定的HeLa细胞中的Gd含量Table 3 Cellular uptake of Gd-(DTPA-NCMCS),Gd-(DTPA-CS)and Gd-DTPA by HeLa cells in terms of Gd content determined by ICP-MS

3 结论

综上所述，本研究选择具有优良性能的N-羧甲基壳聚糖修饰DTPA，合成了配合物Gd-(DTPANCMCS)。该化合物具有以下优良性能：(1)在生理条件下具有良好的稳定性；(2)高弛豫性能，Gd-(DTPA-NCMCS)在水溶液中的r1高于临床造影剂Gd-DTPA，且高于Gd-(DTPA-CS)。较高的弛豫率表明在较低的钆量下可以达到同等的MRI对比增强效果，从而可降低金属离子在体内引发的毒性；(3)Gd-(DTPA-NCMCS)的低毒性和较高的细胞摄取率表明配合物Gd-(DTPA-NCMCS)有望成为性能优良的新型MRI造影剂。

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