超高效液相色谱-串联质谱法检测鱼中孔雀石绿、结晶紫及其代谢物

张艺蓓，岳田利,，乔海鸥，贾 如，蒋旭鹏，李 璐

（1.西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100；2.陕西省疾病预防控制中心，陕西 西安 710054）

超高效液相色谱-串联质谱法检测鱼中孔雀石绿、结晶紫及其代谢物

张艺蓓1，岳田利1,*，乔海鸥2，贾 如1，蒋旭鹏1，李 璐1

（1.西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100；2.陕西省疾病预防控制中心，陕西 西安 710054）

采用超高效液相色谱-串联质谱法同时测定鱼中孔雀石绿（malachite green，MG）、隐性孔雀石绿（leuco malachite green，LMG）、结晶紫（crystal violet，CV）、隐性结晶紫（leuco crystal violet，LCV）4种物质残留。样品加入内标物D5-MG、D6-LMG、D5-CV、D6-LCV，经乙腈提取、离心、过中性氧化铝柱，氮气吹至近干，50%乙腈溶液定容，上机测定。MG和LMG线性范围为1～50 ng/mL，CV和LCV线性范围为1～100 ng/mL。4种物质的检出限均为0.05 μg/kg，定量限均为0.15 μg/kg。在50、100、200 ng/mL 3个添加水平下，回收率在87.80%～110.82%之间，相对标准偏差均小于等于4.32%（n=6）。该方法灵敏、准确、可靠，可以同时测定鱼中MG、LMG、CV、LCV残留。

超高效液相色谱-串联质谱；鱼；孔雀石绿；结晶紫；残留

孔雀石绿（malachite green，MG）和结晶紫（crystal violet，CV）属于三苯甲烷类物质，是纺织工艺中使用的染料，因其具有消毒性和杀菌性而曾用于水产养殖和运输过程中，作为驱虫剂和杀菌剂防治鱼类水霉病、烂腮病及寄生虫病，延长鱼类的存活时间[1]。MG是一种带有金属光泽绿色的结晶体，化学名称为四甲基代二氨基三苯甲烷，化学式为C23H25ClN2，易溶于水、甲醇、乙醇和戊醇，水溶液呈蓝绿色。CV是一种带有金属光泽深绿色的固体，化学式为C25H30ClN3，与孔雀石绿的结构相似。分子结构见图1。二者进入生物体内，会产生毒性更大的隐性代谢产物，如隐性孔雀石绿（leuco malachite green，LMG）和隐性结晶紫（leuco crystal violet，LCV）[2]。这2种隐性代谢物具有较高的亲脂性，在鱼类脂肪组织中代谢速度极慢，会形成稳定的残留并有明显的蓄积现象。20世纪90年代研究陆续发现MG、LMG、CV、LCV的三苯甲烷官能团具有致癌性，具有高毒、高残留的特性，可通过食物链对哺乳动物和人类产生“三致”作用，对生物体组织、生殖、免疫系统均有影响[3]。因此许多国家将其列为渔用禁用药物，美国、加拿大、日本、欧盟禁止MG和CV在水产品养殖和运输过程中使用[4]。2002年我国NY 5071—2002《无公害食品：渔用药物使用准则》[5]中将MG列为禁用渔用药物；2002年5月农业部将MG和CV列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》[6]。但由于MG和CV抗菌效果好且价格低廉，尚未有更理想的替代品，仍出现在鱼卵孵化过程和运输过程中使用该类化合物的现象[7]。因此，对MG和CV的检测和监控显得尤为重要。对MG和CV的检测有许多不同的方法，如高效液相色谱法、液相色谱-线性离子阱质谱法、共振瑞利散射法、同位素内标测定法和薄层色谱法等[8-15]。但这些方法的灵敏度、选择性和分析通量还存在不足之处，高效液相色谱法对样品的净化要求高，操作步骤繁琐、耗时长，不利于准确定性和定量；国外主要采用气相色谱-质谱联用法测定LMG，高效液相色谱法、高效液相色谱-质谱法同时测定MG和LMG[8,16]。但是所有利用液相色谱测定LMG的方法都需要在色谱柱后串接PbO2衍生柱，将LMG转化为MG，操作步骤繁琐，而且PbO2衍生柱的质量和寿命影响结果的稳定性及检测结果。超高效液相色谱-串联质谱法（ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLCMS-MS）是近年来发展起来的一种新的检测技术，使用三重串联四极杆质谱或离子阱作为检测器，代替高效液相色谱仪中的紫外检测器，能同时发挥液相色谱的较快分析速度、高分离度与串联质谱的高选择性、高灵敏度的优势，采用多反应监测扫描方式提供特征母离子及子离子信息，能较好地进行目标化合物的定性和定量。目前，UPLC-MS-MS方法同时测定MG、LMG、CV、LCV残留在国内外的报道均较少，本研究采用该法，对陕西省16种水产品中MG、LMG、CV、LCV进行残留测定，减少了样品分析操作步骤，提高了方法的灵敏度和准确度，符合残留分析的要求，为进出口水产品中孔雀石绿类药物残留监测提供了有效的技术支持。

图1 MG、LMG、CV、LCV的分子结构Fig.1 Molecular structures of MG, LMG, CV and LCV

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

标准品MG、LMG、CV、LCV、D5-MG、D6-LMG、D5-CV、D6-LCV（纯度99%） 美国Sigma-Aldrich公司；甲酸、乙腈、乙酸铵（色谱纯） 德国Merck公司；中性氧化铝萃取小柱（1g/6mL） 美国Supelco公司；Millipore A10纯水系统 美国Millipore公司。

1.2 仪器与设备

UltiMateTM3000超高效液相色谱仪 美国Dionex公司；API-3200三重四极杆质谱仪 美国Applied Biosystems公司。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱：Acclaim RSLC C8快速分离色谱柱（2.1 mm×100 mm，2.2 μm）；流动相A为乙腈，B为含0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸铵溶液；流速0.3 mL/min；柱温35 ℃；进样体积10 μL。

1.3.2 质谱条件

电喷雾离子源（正离子模式）；多反应监测模式；电喷雾电压5 500 V；气帘气压力20 psi；雾化气压力40 psi；辅助气压力40 psi；离子源温度450 ℃；其他参数见表1。

表1 4种待测物的最优质谱条件Table1 Optimized MRM conditions for four analytes

1.3.3 标准溶液的制备

标准储备液（1 mg/mL）：精确称取MG、LMG、CV、LCV标准品10 mg分别置于4 个10 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容至刻度，-18 ℃保存；混合标准工作液（100 ng/mL）：分别准确移取1 mg/mL的MG、LMG、CV、LCV标准储备液0.1 mL，用乙腈稀释成1 μg/mL的混合标准中间液，再取混合标准中间液用乙腈稀释成100 ng/mL的混合标准工作液，4 ℃保存；内标储备液（1 mg/mL）：分别精确称取孔雀石绿、隐性孔雀石绿同位素内标标准品D5-MG、D6-LMG、D5-CV、D6-LCV 10 mg（精确到0.01 mg）于4 个10 mL棕色容量瓶中，分别用乙腈定容至刻度，-18 ℃保存；混合内标工作液（1 ng/mL）：分别准确移取1 mg/mL的4 种内标储备溶液0.1 mL，用乙腈稀释成l00 ng/mL的混合内标中间液，再取混合内标中间液用乙腈稀释成1 ng/mL的混合内标工作液，4 ℃保存；标准系列溶液：分别取100 ng/mL的混合标准工作液0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mL于10 mL容量瓶中，用50%乙腈溶液定容至刻度，得到质量浓度依次为1、5、10、20、50、100 ng/mL的标准系列溶液。

1.3.4 样品处理

1.3.4.1 样品的制备

从市场上采集16 个品种共计120 条鱼，经剖杀去除头、骨、内脏，取可食部分切成块状，用电动绞肉机打成浆状，于-18 ℃保存，待测。

1.3.4.2 提取和净化

将鱼样解冻，准确称取5 g（精确到0.1 g）样品于50 mL塑料离心管中，添加50 μL混合同位素内标中间液，加入提取液乙腈25 mL，涡旋混合2 min，10 000 r/min离心10 min，收集上清液于100 mL玻璃离心管中，待净化。

用5 mL乙腈活化中性氧化铝萃取小柱，在氮吹仪上用氮气吹干；取5 mL上清液，加载在中性氧化铝小柱上，收集滤液，再用4 mL乙腈淋洗小柱，再收集滤液，将2 次滤液合并；在氮吹仪上50 ℃用氮气吹至近干，用50%乙腈溶液溶解残渣，并定容至0.5 mL，0.22 μm膜过滤，待检测。

2 结果与分析

2.1 提取与净化

由于MG和CV在水产品中主要以隐性代谢物LMG和LCV形式存在，具有很好的亲脂性，而且水产品基质化学成分复杂，脂肪含量较高，不利于目标分析物的提取和净化。各种氧化铝小柱（酸性氧化铝、中性氧化铝、碱性氧化铝）可以去除样品中的脂肪[17-18]，但也可吸附目标化合物。用乙腈活化过的酸性氧化铝和中性氧化铝对LMG、LCV的吸附很弱，而碱性氧化铝对LMG、LCV的吸附较强。因此，本研究在样品的前处理过程中，利用中性氧化铝固相萃取净化，去除酸性杂质，消除了油脂和基体的影响，保护了色谱柱和质谱仪，提高了方法的灵敏度。

检测水产品中残留的MG、CV及其隐性代谢物时常使用的提取溶剂包括乙酸铵缓冲溶液、乙腈、甲醇、二氯甲烷等。由于LCV在乙腈中的溶解度要高于甲醇，本研究选择乙腈做为提取剂，提高了目标物的提取效率，并减少溶液的多次转移造成的损失。同时，在样品提取和净化过程中，微量的LMG、LCV被氧化为MG、CV，文献[19]报道加入还原能力更强的物质能有效防止这种情况的发生，而本实验则采用加入稳定性同位素内标物质来提高测定的准确性。

2.2 质谱和色谱条件的优化

本研究采取UPLC-MS-MS法进行分析，同时根据现有仪器、试剂和实际操作等情况，参照GB/T 19857—2005《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定》[20]、SC/T 3021—2004《水产品中孔雀石绿残留量的测定：液相色谱法》[21]，优化检测方法。

图2 标准液相色谱图谱Fig.2 UPLC profiles of standards

对MG、LMG、CV、LCV、D5-MG、D6-LMG、D5-CV、D6-LCV扫描母离子，得到其准分子离子峰，再以适当的碰撞能量扫描分子离子，响应值最强的子离子为定量离子，响应值相对较强的离子为定性离子。这2个信号较强的子离子，以母离子和子离子组成监测离子对；采用多反应监测模式对母离子和子离子进行碎裂电压及碰撞能量的优化（表1），满足欧盟规定对于禁用药物的质谱确证方法的要求[22]，使得样品定量离子与定性离子的离子强度比在其相应的标准系列离子强度比的80%～120%范围内，可作为准确定性的依据。

MG、LMG属于三苯基甲烷类化合物，具有弱碱性，因此可以通过调节流动相的pH值来抑制弱碱的解离，同时加入甲酸和低浓度的挥发性缓冲盐可以在离子化过程中得到丰富的离子碎片信息，并改善峰形。本实验中，流动相中加入5 mmol/L乙酸铵，用乙酸调节pH 4.5，获得良好的峰形，提高了灵敏度（图2）。MG、LMG、CV、LCV、D5-MG、D6-LMG、D5-CV、D6-LCV保留时间分别为1.62、6.03、2.72、5.66、1.59、5.96、1.59、5.96 min。

为了能同时检测显色母体和隐性代谢物，通常在液相色谱分离后，利用一个在线柱后PbO2衍生柱，将隐性代谢物LMG、LCV转化为在可见光波长处有强吸收的显色母体（MG和CV）。但是衍生柱填料的配比容易受到流动相和样品基质的影响，衍生柱的寿命也会影响检测效果，使得结果不准确。本研究未使用PbO2衍生柱，避免了衍生柱质量不稳定对检测结果造成的影响。

2.3 标准曲线及检出限

本研究采用内标法进行定量，在空白鱼肉样品中添加4种抗生素的标准溶液，由标准储备液配制质量浓度为1、5、10、20、50、100 ng/mL的混标溶液，分别取10 μL测定，以分析物质量浓度与内标物质量浓度的比值为横坐标、 以分析物峰面积与内标物峰面积的比值为纵坐标，绘制标准曲线。

Bergwerff等[23]利用LC-MS-MS方法对鲶鱼、鳗鲡、虹鳟、鲑鱼、热带虾、大比目鱼肌肉组织中的MG和LMG进行了测定，检出限均达到0.2 μg/kg。Turnipseed等[24]采用非放电气压化学离子化的离子阱质谱法对鲑鱼肌肉组织中的MG进行了测定，先将LMG氧化成MG，然后进行检测，检测限达到0.2 μg/kg，可食用金鱼组织中的MG和LMG的检测限分别达到0.13 μg/kg和0.06 μg/kg。本研究4 种物质的检出限为0.05 μg/kg，定量限为0.15 μg/kg，优于欧盟2004年提出的检测限要求（2 μg/kg）[25]，同时达到目前水产品中MG和LMG检出限的最低水平。

MG、LMG在质量浓度为1～50 ng/mL的范围内呈现良好的线性关系，CV、LCV在质量浓度为1～100 ng/mL的范围内呈现良好的线性关系，线性范围宽，灵敏度高（表2）。

表2 回归方程、相关系数及检出限、定量限Table2 Linear regression equations with correlation coefficients, LODs, and LOQs of veterinary drugs

2.4 加标回收率和精密度

以阴性样品进行加标回收实验，使用3组阴性样品为测试样品，MG、LMG、CV、LCV的3个添加水平为50、100、200 ng/mL，每个添加量在相同的实验条件下做6个平行样，对照标准工作曲线计算每个样品的质量浓度，计算加标回收率、相对标准差，平均加标回收率为87.80%～110.82%，相对标准偏差均小于等于4.32%，达到较好的准确度及精密度（表3）。

Bergwerff等[23]的研究中，几种鱼类组织中MG和LMG的平均回收率分别为43.8%～67.6%和86%～105%。Turnipseed等[24]的研究中，鲑鱼组织中MG的平均回收率为86%～109%，可食用金鱼组织中的MG和LMG的平均回收率分别是71%和89%以上。同时，Bergwerff等[23]认为，检测时应尽量避免样品的反复冻融，否则会影响物质的回收率；此外储存温度对2种物质的稳定性影响较大，当贮藏温度为4℃、贮藏4 d时，对其测定影响很大，检测值只有未贮藏时的60%左右。因此，本研究在储存样品时采用分瓶存放的形式，避免了反复冻融；在贮藏温度为-18℃、贮藏时间不超过3 d时及时进行测定。

表3 回收率和精密度实验（n=6）Table3 Recoveries of spiked samples and RSDs (n=6)

2.5 实际样品的测定

图3 鱼样品液相色谱图谱Fig.3 UPLC profiles of samples

应用此方法检测市售的120份鱼样品，其中MG阳性样品2份，质量浓度为2.2 μg/kg；LMG阳性样品8份，质量浓度为8.6 μg/kg；CV阳性样品12份，质量浓度为5.24 μg/kg；LCV未检出阳性样品。结果表明，市售的鱼样品中仍然存在滥用MG和CV的情况（图3）。

3 结 论

本研究建立了UPLC-MS-MS同时测定批量鱼样品中MG、LMG、CV、LCV残留量的方法。样品中MG、LMG、CV、LCV直接用乙腈提取，简化了样品前处理步骤，并加入稳定同位素内标进行校正，降低基质抑制效应。在3个添加水平下的回收率、精密度良好，检出限低。同时发挥液相色谱的较高的分析速度、高分离度与串联质谱的高选择性、高灵敏度的优势，采用多反应监测扫描方式提供特征的母离子及子离子信息，较好地进行目标化合物的定性、定量，达到高效、快速、操作简单、重复性好、结果准确的效果，满足水产品进出口检测的要求。

[1] 卢迈新, 黄漳翰, 肖学铮, 等. 美洲鳗对几种药物的敏感性研究[J].淡水渔业, 2000, 30(5): 28-29.

[2] 王明俊. 兽医生物制品学[M]. 北京: 中国农业出版社, 1997: 344.

[3] FERNANDES C, LALITHA V S, RAO K V K. Enhancing effects of malachite green on the development of hepatic pre-neoplastic lesions induced by N-nitrosodiethylamine in rats[J]. Carcinogenesis, 1991, 12(5): 839-845.

[4] CULP S J, BLANKENSHIP L R, KUSEWITT D F, et al. Toxicity and metabolism of malachite green and leuco malachite green during short -term feeding to F344 rats and B6C3F1 mice[J]. Chemico-Biological Interactions, 1999, 122(3): 153-170.

[5] 农业部. NY 5071—2002 无公害食品: 渔用药物使用准则[S]. 北京:农业部, 2002.

[6] 农业部. 农业部193号公告: 食品动物禁用的兽药及其它化合物清单[S].北京: 中国标准出版社, 2002.

[7] 何丽华, 沈国顺, 邹伟, 等. 孔雀石绿及其危害[J]. 特养与水产, 2006, 27(5): 45-46.

[8] 郭德华, 叶长淋, 李波, 等. 高效液相色谱-质谱法测定水产品中孔雀石绿及其代谢物[J]. 分析测试学报, 2004, 23(增刊1): 206-208.

[9] 李会荣, 李桂华, 宫玲玲, 等. 高效液相色谱法快速测定饲料中孔雀石绿和无色孔雀石绿的研究[J]. 中国饲料, 2010, 31(13): 35-37.

[10] 吴学立, 吴永宁, 赵云峰, 等. 液相色谱-线性离子阱质谱法检测草鱼中孔雀石绿、结晶紫及其代谢产物[J]. 中国食品卫生杂志, 2007, 19(3): 209-214.

[11] 陈其勇, 葛宗坤, 宓捷波, 等. 高效液相色谱法与酶免疫法快速测定鲫鱼中残留显/隐色孔雀石绿的比较[J]. 理化检验: 化学分册, 2008, 44(1): 68-70.

[12] 叶四化, 陆超华, 谢海平, 等. 高效液相色谱双波长法、同时测定水产品中孔雀石绿和隐性孔雀石绿[J]. 分析科学学报, 2007, 23(1): 69-72.

[13] 李永夫, 高华鹏, 姚芳, 等. 高效液相色谱法检测鳗鱼中孔雀石绿及其代谢物残留[J]. 安徽农业科学, 2009, 37(1): 31-33.

[14] 孙言春, 吴松, 牟振波, 等. 液相色谱串联质谱法测定鲤科鱼受精卵、卵巢及精巢中孔雀石绿及隐色孔雀石绿残留[J]. 中国渔业质量与标准, 2012, 2(1): 80-86.

[15] 胡萍, 赵鹏, 余少文, 等. 高效液相色谱法监测市售水产品中孔雀石绿[J]. 深圳大学学报: 理工版, 2012, 29(1): 61-66.

[16] HURTAUD-PESSEL D, COUEDOR P, VERDON E. Liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for the determination of dye residues in aquaculture products: Development and validation[J]. Journal of Chromatography A, 2011, 1218(12): 1632-1645.

[17] RUSHING L G, Jr. THOMPSON H C. Simultaneous determination of malachite green, gentian violet and their leucometabolites in cat fish or trout tissue by high-performance liquid chromatography with visible detection[J]. Journal of Chromatography B, 1997, 688(2): 325-330.

[18] 金雁, 刘宁, 姚家彪, 等. 高效液相色谱法测定水产品中孔雀石绿和隐色孔雀石绿残留量[J]. 现代仪器, 2006, 12(3): 52-54.

[19] 江洁, 林洪, 徐杰. 孔雀石绿及无色孔雀石绿的固相萃取性能比较[J].理化检验: 化学分册, 2008, 44(10): 965-967.

[20] 国家质量监督检验检疫总局. GB/T 19857—2005 水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定[S]. 北京: 中国标准出版社, 2005.

[21] 农业部. SC/T 3021—2004 水产品中孔雀石绿残留量的测定: 液相色谱法[S]. 北京: 中国标准出版社, 2004.

[22] European Commission. Commission Decision (EC) No. 657/2002 of 12 August 2002 implementing Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results[J]. Official Journal of the European Union, 2002, L221: 8.

[23] BERGWERFF A A, SCHERPENISSE P. Determination of residues of malachite green in aquatic animals[J]. Journal of Chromatography B, 2003, 788(2): 351-359.

[24] TURNIPSEED S B, ANDERSEN W C, ROYBAL J E. Determination of residues of malachite green and leucomalachite green residues in salmon using liquid chromatography/mass spectrometry with nodischarge atmospheric pressure chemical ionization[J]. Journal of AOAC International, 2005, 88(5): 1312-1317.

[25] European Commission. Commission decision 2004/25/EC of 22 December 2003 amending Decision 2002/657/EC as regards the setting of minimum required performance limits (MRPLs) for certain residues in food of animal origin[J]. Official Journal of the European Union, L006: 38-39.

Determination of Malachite Green, Crystal Violet and Their Metabolites in Fishes by Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

ZHANG Yi-bei1, YUE Tian-li1,*, QIAO Hai-ou2, JIA Ru1, JIANG Xu-peng1, LI Lu1
(1. College of Food Science and Engineering, Northwest A & F University, Yangling 712100, China; 2. Shaanxi Provincial Center for Disease Control and Prevention, Xi’an 710054, China)

Purpose: Malachite green (MG), leuco malachite green (LMG), crystal violet (CV) and leuco crystal violet (LCV) residues in fish were determined simultaneously using ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS-MS). Methods: Fish samples after addition of internal standards D5-MG, D6-LMG, D5-CV, and D6-LCV were extracted with acetonitrile and centrifuged, and then the supernatants were applied on a neutral alumina column, blown almost dry under a stream of nitrogen and re-dissolved in 50% aqueous acetonitrile (by volume) before being subjected to UPLC-MS-MS analysis. Results: A linear relationship was observed over a concentration range of 1–50 ng/mL for MG and LMG, and over a concentration range of 1–100 ng/mL for CV and LCV. The limits of detection (LOD) for MG, LMG, CV and LCV were 0.05 μg/kg and the limits of quantification (LOQ) for all of them were 0.15 μg/kg. Average recoveries from blank samples spiked at levels of 50, 100 and 200 ng/mL ranged from 87.80% to 110.82%, with relative standard deviation smaller than or equal to 4.32% (n = 6). Conclusions: This method proved sensitive, accurate and reliable.

ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS-MS); fish; malachite green (MG); crystal violet (CV); residues

TS207.3

A

1002-6630（2014）10-0179-06

10.7506/spkx1002-6630-201410034

2013-09-24

2013年度西北农林科技大学“大学生创新创业训练计划”校级重点项目（1201310712174）

张艺蓓（1993—），女，本科生，研究方向为食品安全。E-mail：zhangyibei0666@163.com

*通信作者：岳田利（1965—），男，教授，博士，研究方向为食品与发酵工程及食品安全控制技术。E-mail：yuetl@nwsuaf.edu.cn