聚合酶链式反应快速检测畜肉食品中鸭源性成分

史艳宇，刘金华，王 莹，邴 炜，华 蕾，刘晓晖，王 颖，周 亮，王 潇

（1.吉林省产品质量监督检验院，吉林 长春 130022；2.吉林出入境检验检疫局，吉林 长春 130062）

聚合酶链式反应快速检测畜肉食品中鸭源性成分

史艳宇1，刘金华2，王 莹1，邴 炜1，华 蕾1，刘晓晖1，王 颖1，周 亮1，王 潇1

（1.吉林省产品质量监督检验院，吉林 长春 130022；2.吉林出入境检验检疫局，吉林 长春 130062）

目的：建立一种快速、特异、灵敏的鸭源性成分检测方法。方法：以鸭细胞色素C氧化酶Ⅲ（COⅢ）基因序列为靶位点设计引物，进行聚合酶链式反应扩增，建立鸭源性成分检测方法；以常见畜禽肉，包括羊肉、牛肉、鸡肉、鹅肉、猪肉、兔肉、马肉、鹿肉等参考动物物种进行特异性检测；以50 mg/kg羊肉DNA作为稀释液，对鸭肉DNA进行梯度稀释，检测灵敏度。结果：该方法能够有效的对鸭源性成分进行快速检测，具有较强的特异性，灵敏度较高（0.1 μg/kg），且羊肉成分的存在对鸭肉灵敏度检测没有影响，可以快速、准确检测畜肉食品中掺杂的鸭源性成分。

鸭源性成分；细胞色素C氧化酶Ⅲ基因；聚合酶链式反应；检测

市售牛羊肉及肉制品中，很多都掺杂鸭肉以冒充牛羊肉进行销售；为弥补羊肉味不足，有些不法商家甚至掺入羊肉粉、羊肉精膏等添加剂来粉饰其掺假行为。为了确定畜肉食品的真实性，已经有很多动物源性成分鉴别的方法，包括物理、化学、免疫学和分子生物学等方法，其中尤以分子生物学方法中聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）最为快速且灵敏[1-16]，其中相关标准也很多，涵盖牛、羊、猪、狗、鸡、马、驴、鹿、兔、骆驼等动物种类[17-22]，但尚无对鸭源性成分鉴别检测的相关标准，满足不了检测需求。

研究中建立的畜肉食品中鸭源性成分鉴别检测方法，采用主要选择鸭细胞色素C氧化酶Ⅲ（COⅢ）DNA作为研究对象，设计了PCR特异性引物，建立了PCR技术鉴别检测鸭源性成分的方法，适用于不同类型的样品检测，操作简便，准确可靠，灵敏度高，实用性强。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

家鸭（雁形目鸭亚科河鸭属的绿头鸭[23]）、羊肉、牛肉、鸡肉、鹅肉、猪肉、兔肉、马肉、鹿肉均购于长春市地方市场；冰冻羊肉卷、肉板、酱鸭脖、酱鸭肠等畜肉加工食品购于长春市超市。

AxyPrepTMDNA提取试剂盒 美国Axygen公司；Ex TaqDNA聚合酶、dNTP（各10 mmol/L）、10×缓冲液、6×Loading buffer、100 bp DNA Ladder Marker、PCR引物合成 宝生物工程（大连）有限公司。

1.2 仪器与设备

Microfuge 22R高速冷冻离心机 美国Beckman公司；IKA M20食物研磨器 德国IKA公司；Biometra T gradient-96PCR扩增仪 德国Biometra公司；BioSpecmini DNA/RNA/蛋白分析仪 日本岛津公司；SAVANT PS500A电泳仪 美国Axygen公司；EDAS290凝胶成像系统 美国柯达公司；HH-S恒温水浴锅 上海博珍仪器设备制造厂。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

取500 mg固体样品加入50 mL离心管，加入约2 倍体积的双蒸水，充分混匀，12 000 r/min离心5 min并弃去上清液，重复1次，必要时用三氯甲烷清洗样品1次。酱汁等悬乳浊或浊状的液体食品样品可以通过添加电解质（无机酸、碱、盐类）等物理方式破坏胶体稳定性再分离、浓缩。取500 mg样品加入2 mL离心管，12 000 r/min离心5 min并弃去上清液，再次加入500 mg样品，12 000 r/min离心5 min并弃去上清液，必要时用三氯甲烷清洗样品1 次。

1.3.2 DNA提取

按试剂盒说明书提取DNA，并用DNA分析仪检测其纯度及浓度。

十六烷基三甲基溴化铵（hexadecyltrimethylammon iumbromide，CTAB）法提取DNA：取200 mg研磨成粉状的样品于1.5 mL离心管中，加入600 μL CTAB、15 μL蛋白酶K、65 ℃温育30 min；加入500 μL酚-氯仿-异戊醇（25：24：1，V/V）混合液剧烈振荡，12 000 r/min离心15 min；吸取上清液加入等体积异丙醇，剧烈振荡后12 000 r/min离心10 min，弃上清液；用70%乙醇洗涤2～3次，弃上清液；用200 μL TE缓冲液溶解；加等体积氯仿-异戊醇（24：1，V/V）重复上述步骤纯化DNA。用DNA分析仪检测其纯度及浓度。

1.3.3 引物设计

在GenBank中检索到的1个潜鸭族基因全序列（accession AF090337）、其绿头鸭的mtDNA部分序列（accession L22476、L16770、L22477）及家鸭线粒体COⅢ基因序列（accession DQ655706）。用Lasergene软件中的MegAlign对基因序列进行序列同源性比较分析，根据基因序列中同源性较高部分用Primer Express 3.0设计引物。在GeneBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/ BLAST）中，经BLAST软件对相似序列搜索后，筛选出一套最优且与常见畜禽肉无交叉反应的引物。正向引物：5’-CATCTATCCTGCTAGCCGCC-3’，反向引物：5’-GGCTTGAGTGGAAGAATGCC-3’，扩增片段201 bp。

1.3.4 反应体系和反应条件

反应体系（共25 øL）：10×Ex Taq Buffer（Mg2+plus）2.5 øL，dNTP s Mixture（各10 mmol/L）0.5 øL，上下游引物（10 ømol/L）各1 øL，Ex Taq（5 U/øL）0.2 øL，模板DNA 2 øL，补水至25 øL。

反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环；最后72 ℃延伸10 min。

1.3.5 特异性实验

分别用羊肉、牛肉、鸡肉、鹅肉、猪肉、兔肉、马肉、鹿肉等对引物进行特异性实验。

1.3.6 灵敏度实验

用羊肉DNA（50 mg/kg）溶液对鸭肉DNA进行10倍梯度稀释，使羊肉DNA中分别含有100、10、1 mg/kg和100、10、1、0.1 øg/kg的鸭肉DNA，进行PCR扩增，观察该方法灵敏度及羊肉成分的存在对鸭肉检测灵敏度的影响。

2 结果与分析

2.1 引物特异性

在优化好的PCR反应体系和反应条件下，以羊肉、牛肉、鸡肉、鹅肉、猪肉、兔肉、马肉、鹿肉等DNA为特异性实验对照进行PCR检测。电泳结果显示，仅有家鸭被扩增出条带，而其他对照以及空白对照均未扩增出条带（图1）。

图1 PCR特异性检测结果Fig.1 Specificity of the PCR method

2.2 灵敏度

图2 PCR灵敏度检测结果Fig.2 Sensitivity of the PCR method

对用羊肉DNA溶液稀释的各质量浓度鸭肉DNA进行PCR检测，结果显示，设计的引物对鸭肉的检测敏感度可达到0.1 øg/kg。同时，高质量浓度羊肉DNA的存在并不影响鸭肉的检测灵敏度（图2）。

2.3 市售羊肉卷和肉板中鸭源性成分的检测

应用特异引物对2份市售的羊肉卷及肉板（经证明已掺入鸭肉）进行PCR检测，结果表明该方法能有效检测出试样中掺入的鸭源性成分（图3）。

图3 检测样品中的鸭源性成分Fig.3 Qualitative detection of duck-derived materials in commercial meat products

2.4 市售加工肉制品中鸭源性成分的检测

加工肉制品由于需要经过高温处理或添加盐类等调料制品，这些处理方式对DNA的提取效果均有影响。应用特异性引物对市售的鸭脖、鸭肠制品进行PCR检测，结果表明样品通过洗涤方式去除样品中的盐、糖和色素后，经PCR扩增仍能够检测出鸭源性成分（图4）。

图4 检测加工制品中的鸭源性成分Fig.4 Qualitative detection of duck-derived materials in processed meat products

3 结 论

本研究根据鸭COⅢ基因序列设计特异性引物，成功建立了鸭源性成分的PCR检测方法，填补了鸭源性成分检测方法及标准的空白。

在本研究中，对所设计引物进行特异性预测及实际检验，结果表明所用引物与常见畜禽物种间无同源性，引物具有较高的特异性。另外，采用50 mg/kg羊肉DNA溶液对鸭肉DNA进行稀释，结果表明较高质量浓度羊肉DNA的存在不影响鸭肉检测的灵敏度（0.1 μg/kg），能够满足实际检测需要。另外，肉制品经加工等工序后，DNA会受到影响，特别是加热时DNA片段会变短，因此要求引物扩增的目的片段较短[24-25]。本研究中设计的引物所扩增的目的片段为201 bp，适于加工的肉制品中鸭源性成分的检测。本研究中所采用方法可应用于肉制品掺假诊断、食品生产环节污染监控及食品监督部门检测等各个领域，为检测食品中掺假、造假提供技术支持，同时为食品安全工作顺利开展打下良好技术基础。

[1] TARTAGLIA M, SAULLE E, PESTALOZZA S, et al. Detection of bovine mitochondrial DNA in ruminant feeds. A molecular approach to test for the presence of bovine-derived materials[J]. Journal of Food Protection, 1998, 61(5): 513-518.

[2] HOPWOOD A J, FAIRBROTHER K S, LOCKLEY A K, et al. An actin gene-related polymerase chain reaction (PCR) test for identification of chicken in meat mixtures[J]. Meat Science, 1999, 53(4): 227-231.

[3] 张慧霞, 张利平, 吴建平, 等. 鹌鹑源性成分PCR检测方法的建立[J].中国兽医科学, 2008, 38(4): 346-349.

[4] 张慧霞, 吴建平, 宗卉, 等. 应用PCR技术检测禽类源性成分[J]. 中国畜牧杂志, 2008, 44(11): 46-48.

[5] 汪燕玲, 宗卉，阮周曦, 等. 鹅源性成分PCR检测方法的建立[J]. 安徽农业科学, 2009, 37(24): 11432-11434.

[6] 张慧霞, 宗卉, 吴建平, 等. 应用SYBR GreenⅠ实时荧光PCR溶解曲线检测鹌鹑源性成分[J]. 中国畜牧杂志, 2010, 46(17): 70-72.

[7] 曹际娟, 卢行安, 秦成, 等. 实时荧光PCR技术检测肉骨粉中牛羊源性成分的方法[J]. 生物技术通讯, 2002, 13(2): 158-160.

[8] 赵冉, 蔡振鸿, 陈永锋, 等. 动物产品及饲料中牛源和羊源性成分三重荧光PCR检测方法的建立[J]. 畜牧与兽医, 2012, 44(7): 18-22.

[9] 于凤芹, 王金玲, 庞杰, 等. 实时荧光PCR 法检测饲料中鸡源性成分[J].中国动物检疫, 2009, 26(5): 57-58.

[10] 宗卉, 曾少灵, 林庆燕, 等. 饲料中马、驴源性成分的分子生物学检测技[J]. 中国草食动物, 2005, 25(5): 3-6.

[11] 段宏安, 张睿, 李金华, 等. 食品及饲料中动物性成分种类的鉴别方法[J]. 中国兽医杂志, 2002, 38(12): 42-44.

[12] 杨宝华, 宗卉, 林庆燕, 等. 用分子生物学方法鉴别检测动物源性饲料中的牛羊源性成分[J]. 中国畜牧杂志, 2002, 38(1): 3-5.

[13] BOTTERO M T, DALMASSO I A, NUCERA D, et al. Development of a PCR assay for the detection of animal tissue in ruminant feeds[J]. Journal Food Protection, 2003, 66(12): 2307-2312.

[14] 张娟, 宗卉, 张利平, 等. PCR-mtDNA技术鉴别检测不同动物肌肉组织和饲料中鸭源性成分[J]. 生物工程学报, 2008, 24(10): 1832-1836.

[15] 王静, 宗卉, 刘丑生, 等. 鹧鸪线粒体COⅡ、ATPase8和3个tRNA基因序列分析及物种鉴别研究[J]. 中国畜牧兽医, 2008, 35(4): 52-55.

[16] 张驰, 邱皓璞, 张筠, 等. 荧光定量PCR检测肉制品中鸭源性成分[J].食品科学, 2013, 34(18): 154-157.

[17] 国家质量监督检验检疫总局. SN/T 2557—2010 畜肉食品中牛成分定性检测方法: 实时荧光PCR法[S]. 北京: 中国标准出版社, 2010.

[18] 国家质量监督检验检疫总局. GB/T 21101—2007 动物源性饲料中猪源性成分定性检测方法: PCR方法[S]. 北京: 中国标准出版社, 2007.

[19] 国家质量监督检验检疫总局. GB/T 21106—2007 动物源性饲料中鹿源性成分定性检测方法: PCR方法[S]. 北京: 中国标准出版社, 2007.

[20] 国家质量监督检验检疫总局. GB/T 21104—2007 动物源性饲料中反刍动物源性成分(牛、羊、鹿)定性检测方法: PCR方法[S]. 北京:中国标准出版社, 2007.

[21] 国家质量监督检验检疫总局. GB/T 21105—2007 动物源性饲料中狗源性成分定性检测方法: PCR方法[S]. 北京: 中国标准出版社, 2007.

[22] 国家质量监督检验检疫总局. SN/T 2051—2008 食品、化妆品和饲料中牛羊猪源性成分检测方法: 实时PCR法[S]. 北京: 中国标准出版社, 2008.

[23] 郑作新, 张荫荪, 唐詹珠, 等. 中国动物志: 鸟纲: 第二卷: 雁形目[M].北京: 科学出版社, 1979: 73-74.

[24] EBBEHOJ E F, THOMSEN P D. Species differentiation of heated meat products by DNA hybridization[J]. Meat Science, 1990, 30(3): 221-234.

[25] EBBEHOJ E F, THOMSEN P D. Differentiation of closely related species by DNA hybridization[J]. Meat Science, 1991, 30(4): 359-366.

A Polymerase Chain Reaction Method for Rapid Detection of Duck-Derived Materials in Meat Products

SHI Yan-yu1, LIU Jin-hua2, WANG Ying1, BING Wei1, HUA Lei1, LIU Xiao-hui1, WANG Ying1, ZHOU Liang1, WANG Xiao1
(1. Jilin Product Quality Supervision Inspection, Changchun 130022, China; 2. Jilin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Changchun 130062, China)

This report describes a rapid polymerase chain reaction (PCR) method to detect duck-derived DNA by using primers corresponding to the duck COⅢ gene. The method was duck specific, free from interference from lumb DNA (50 mg/kg). Its sensitivity was sufficient to detect as low as 0.1 μg/kg duck-derived materials. It can provide a rapid and accurate way to identify duck-derived materials adulteration in meat products without interference of mutton DNA.

duck-derived materials; cytochrome oxidase Ⅲ (COⅢ) gene; polymerase chain reaction (PCR); detection

S853.74

A

1002-6630（2014）08-0163-03

10.7506/spkx1002-6630-201410030

2013-07-10

国家质检总局科技计划项目（2012QK169）

史艳宇（1977—），女，高级工程师，博士，研究方向为食品生物技术。E-mail：shiyanyu219@163.com