厚壳贻贝多糖的提取工艺优化及体外生物活性研究

钟城城，曲有乐，陈 荫

（1.佳木 斯大学食品与药学院，黑龙江 佳木斯 154007；2.浙江海洋学院食品与医药学院，浙江 舟山 316000）

厚壳贻贝多糖的提取工艺优化及体外生物活性研究

钟城城1，曲有乐2,*，陈 荫2

（1.佳木 斯大学食品与药学院，黑龙江 佳木斯 154007；2.浙江海洋学院食品与医药学院，浙江 舟山 316000）

以抗氧化和抗肿瘤活性为指导优化提取工艺，分别采用热水提取，两步联合酶解法（木瓜蛋白酶和胰蛋白酶）从厚壳贻贝中提取和分离纯化具有生物活性的贻贝多糖，对其进行基本理化性质分析和DEAE-Cellulose 52柱层析分离纯化并进行体外抗氧化、抗肿瘤生物活性研究。通过对热水提取法，单一酶提法和联合酶提取法得到的贻贝多糖粗品进行理化性质分析和活性筛选，发现联合酶解提取得到的贻贝粗多糖在得率、纯度和生物活性上均优于其他方法提取得到的粗多糖，其提取粗多糖的得率为23.69%。联合酶提粗多糖体外抗氧化研究表明其对DPPH自由基、超氧阴离子自由基和脂质过氧化物清除的半最大效应浓度（concentration for 50% of maximal effect，EC50）分别为3.75、5.01 mg/mL和2.41 mg/mL；对体外前列腺癌DU-145细胞48 h，IC50为2.93 mg/mL。通过分离纯化后对各组分的得率和组成分析表明：联合酶提可提高贻贝多糖类糖胺聚糖（MT3）的含量，并达到13.5%，单糖组成主要为Man、GlcN、GlcUA、Gal和Fuc，分子质量约为18 kD。和其他组分相比，MT3 组分表现出良好的体外抗肿瘤活性，对体外前列腺癌DU-145细胞48 h，IC50为2.71 mg/mL。通过活性追踪和工艺优化结果表明，热水提取后酶解工艺不仅可以降解蛋白提高多糖的纯度，而且还可以显著提高贻贝多糖中类糖胺聚糖的含量，而贻贝类糖胺聚糖是贻贝多糖的主要活性组分，具有良好的抗肿瘤活性。

贻贝；多糖；提取工艺；抗氧化；抗肿瘤

厚壳贻贝（Mytilus coruscus）为海洋软体动物门双壳纲贝类，又名海红、淡菜，其营养丰富，富含活性物质，是食药两用经济贝类，在浙江舟山海域分布尤为广泛。我国古代对贻贝的药用价值就有研究，《本草汇言》载：淡菜，补虚养肾之药也[1]。现代研究也证实，贻贝提取物具有多种药理活性，包括抗动脉粥样硬化、降血脂、抑制血小板的凝固、抗氧化及抗肿瘤作用[2]。近年来有研究表明厚壳贻贝含有抗肿瘤多糖类物质，是贻贝的重要活性成分之一，受到了广泛的关注，成为海洋动物多糖研究中重要的组成内容[3]。因此，为推动海洋多糖药物的研究，特别是从海洋软体动物资源宝库中开发抗衰老，抗肿瘤的多糖药物[4]，以来自浙江舟山的新鲜厚壳贻贝中提取多糖，优化贻贝多糖提取工艺，对活性多糖组分进行追踪和分离纯化，旨在以活性为指导从工艺优化的角度为促进舟山海域厚壳贻贝多糖的研究和进一步高值化利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

厚壳贻贝购自浙江省舟山市南珍市场，经浙江海洋学院赵盛龙教授鉴定为厚壳贻贝；前列腺癌细胞DU-145细胞株 中国科学院上海细胞所；胰蛋白酶 广西南宁庞博生物工程有限公司；木瓜蛋白酶 亚太恒信生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-苦肼基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazalone，PMP）、牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴盐（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）、透析袋MD34 （3 500） 上海欧韦达仪器科技有限公司；DEAE-Cellulose 52离子胶 上海富众生物科学有限公司；F12 粉培养基 美国Sigma公司；小牛血清 浙江天杭生物科技有限公司；其余试剂均为国产分析纯。

Shodex OH pak SB-804 HQ凝胶色谱柱 北京京京时代科技发展有限公司；RE-2000旋转蒸发器（配有液晶显示界面、数显转速） 上海亚荣生化仪器厂；UV-1800PC紫外-可见分光度计（配有 128×64 位液晶显示器） 上海美谱达仪器有限公司；1100高效液相色谱仪（配有二极管阵列（diode array detector，DAD）检测器和B.04.0X色谱工作站） 安捷伦科技有限公司；CF16RXII 高速冷冻离心机 日本Hitachi公司；ZHJHC1209C型超净工作台 上海智诚分析仪器制造有限公司；Forma 3111型CO2恒温培养箱 美国Thermo公司；CKX41-A32RC型倒置显微镜（配有UIS2光学系统、三目电光源） 日本Olympus公司；680型全自动酶标仪 美国Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 热水提取厚壳贻贝粗多糖（RT粗多糖）

取新鲜的厚壳贻贝，洗净蒸熟后匀浆，5 000 r /min离心15 min，取沉淀，经丙酮脱脂，于50 ℃干燥箱中烘干成丙酮粉。通过对料液比（g/mL）、温度、提取时间、次数以及乙醇沉淀等因素，确定最佳条件[5]。

1.2.2 酶法提取厚壳贻贝粗多糖（MT粗多糖）

选择不同浸提时间、酶用量、料液比、温度、pH值，5 个因素进行单因素试验，探索厚壳贻贝多糖提取的较佳工艺参数，确定各因素最佳水平后，取热水提取物，采用四因素三水平进行正交试验方法，四因素分别为加酶量、pH值、温度、料液比。联合酶法提取分析，加酶量（0.5、1、2%）、木瓜蛋白酶选取pH值（5、6、7）、胰蛋白酶选取pH值（8、9、10）、酶解温度（40、50、60 ℃）、料液比（1：10、1：20、1：30）。以贻贝粗多糖的得率为考察指标，按L9（34）正交表进行试验组合确定各酶的最佳酶解条件后，灭酶15 min后冷却，调节pH值至中性，离心，取上清液旋蒸浓缩，用3 倍体积95%乙醇沉降过夜，收集沉淀，用乙醇和丙酮洗涤，透析，冷冻干燥后即得两步联合酶解法提取粗多糖[6]。

1.2.3 贻贝多糖的分离纯化

离子交换柱层析法[7]。采用 DEAE-Cellulose 52阴离子交换柱（Φ3.5 cm×18 cm）分别对热水提取粗多糖和酶法提取粗多糖分离纯化。上样量1.6 mL（200 mg/mL），流速2.0 mL/min，每管收集10 mL，采用硫酸苯酚法检测[8]，按峰收集各含糖组分，以截留相对分子质量为3.5 kD的透析袋进行透析。取袋内透析液，旋转浓缩，冷冻干燥即得。

1.2.4 贻贝多糖的理化性质分析

总糖含量测定：将贻贝粗多糖配制成5 mg/mL溶液，测试前稀释50 倍。以葡萄糖为标准品，制作标准曲线，用改良的硫酸-苯酚法测定总糖含量。

蛋白含量测定：采用考马斯亮蓝G-250染色法（Bradford法）[9]测定待测样品中蛋白质含量。贻贝粗多糖配制成5 mg/mL的溶液，绘制标准曲线，以牛血清白蛋白为对照品。

糖醛酸含量测定：采用硫酸咔唑法，以葡萄糖醛酸为标准测定糖醛酸的含量[10]，标准葡萄糖醛酸溶液配制0.5 mg/mL；贻贝粗多糖配制成5 mg/mL的溶液，绘制标准曲线。

硫酸根含量测定：采用明胶-比浊法测定各多糖的硫酸根含量[11]。取贻贝粗多糖样品5 mg依次加入1.0 mL稀盐酸和0.5 mL氯化钡-明胶，以无水硫酸钾为标准品，制作标准曲线。

1.2.5 柱前衍生高效液相色谱法测定单糖组成

分别取2 mg的RT多糖、MT多糖和MT3多糖，用三氟乙酸全水解后，取100 μL与PMP衍生后进行高效液相色谱分析。色谱条件：色谱柱：Agilent XDB-C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；柱温：30 ℃；流动相：磷酸盐缓冲液（pH 6.7）-CH3CN（83：17，V/V）；流速：1.0 mL/min；检测器：DAD（245 nm）[12]。

1.2.6 高效凝胶渗透色谱法测定相对分子质量

取适量样品，流动相溶解后，用0.22 μm的微孔滤膜过滤，进样20 μL，用HPLC分析，记录色谱图，将保留时间与标准曲线对照，确定样品相对分子质量。 色谱条件：分析柱：Shodex OH pak SB-804 HQ凝胶色谱柱（7.8 mm×300 mm）；柱温：35 ℃；流动相：0.2 mol/L Na2SO4溶液；流速：0.5 mL/min；示差检测器[13]。

1.2.7 红外光谱分析

分别取干燥的不同方法提取的贻贝多糖2 mg与适量干燥KBr粉末充分研磨后压片，使用Nicolet Nexus 6700红外光谱仪在400～4 000 cm-1范围内扫描[14]。

1.2.8 贻贝多糖抗氧化的测定

分别取质量浓度0、2、4、6、8、10 mg/mL的贻贝多糖样品，按Shimada等[15]研究抗氧化的方法，DPPH自由基的清除能力测定贻贝粗多糖。按Kimuya等[16]研究的抗脂质过氧化能力测定贻贝粗多糖。采用Marklund等[17]研究的邻苯三酚自氧法，超氧阴离子自由基清除能力测定贻贝粗多糖样品。按Yuan Yanfeng等[18]研究还原力的方法，还原力测定贻贝粗多糖。

1.2.9 细胞增殖抑制率的测定

采用MTT法[19]。将MT3配制成质量浓度分别为0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/mL 5个质量浓度组，分别测定作用24、48 h和72 h后，对前列腺癌细胞株DU-145细胞增殖的影响。

2 结果与分析

2.1 贻贝多糖的制备

在热水提取的过程中，影响多糖粗品得率的因素主要有温度、浸提时间、料液比、提取次数、乙醇醇析5 个因素，其中温度、浸提时间、料液比对厚壳贻贝多糖得率影响较大。通过含量检测得到其最适合提取温度90 ℃、时间4 h、料液比1：20，提取后8 000 r/min 离心15 min，取其上清液，按Sevag法除蛋白，经浓缩后，用3 倍体积95%乙醇醇沉过夜，收集沉淀，分别用无水乙醇和丙酮洗涤2 次。透析，冷冻干燥后即得白色粗品，RT多糖，产率为19.74 %。

很多动物多糖，特别是糖胺聚糖都与蛋白质相连，首要问题是在多糖不被显著降解的条件下去除结合的蛋白质，提高多糖的溶解度和得率[20]。蛋白酶水解法是提取动物多糖的理想方法，使蛋白质充分水解。在不改变糖链结构的前提下先用热水提取，依次采用木瓜蛋白酶和胰蛋白酶水解。对于动物多糖的释放十分有效。故选用热水提取完继续进行酶解的两步联合酶解法。

波爱修所定义的永恒是同时、当下的包罗或拥有整个的生命和时间。他批驳了有人因为听说柏拉图主张这个世界在时间上既没有起点也没有终点，就以为受造世界与其造物主同享永恒的观点。这是对第一种永恒的否定。处在永恒之下的神意，就超越了时间，永远处在当下的纯粹之中，并且又拥有未来和过去无限范围内的一切。预知对于神来说，不是关于未来的知识，而是有关永在当下的知识。

联合酶水解工艺参数的选择：分别对木瓜蛋白酶和胰蛋白酶水解进行不同温度（40、50、60、70、80 ℃）；不同时间（1、2、3、4、5 h）；不同料液比（1：10、1：20、1：30、1：40、1：50）；不同加酶量[E]/[S]（0.2%、0.5%、1%、2%、2.5%）；不同pH值（6、7、8、9、10），5 个因素的选择。

单因素试验结果见表1，木瓜蛋白酶水解，60 ℃为提取温度较优值。得到最佳温度后，固定以上其他条件不变的情况下，依此确定最适反应时间3 h、料液比1：20、加酶量1%、pH 7。胰蛋白酶水解方法同上，研究最适宜温度、时间、料液比、加酶量以及pH值分别为最适温度60 ℃、最适反应时间3 h、最适料液比1：20、加酶量0.5%、最适pH 10。

表1 酶法提取贻贝多糖的单因素试验结果Table1 Results of single-factor experiments on enzymatic hydrolysis of Mytilus coruscus muscle

表2 酶法提取贻贝多糖的正交试验结果Table2 Results of orthogonal array experiments on enzymatic hydrolysis of Mytilus coruscus muscle

由表2可看出，各因素对木瓜蛋白酶提取厚壳贻贝多糖收率的影响顺序为ACBD，加酶量和温度是主要影响因素，随着加酶量和温度的增大，得率均上升。通过正交试验确定的最优水平为A3B3C3D2，即提取温度60 ℃、pH 7、料液比1：30、加酶量1%。各因素对胰蛋白酶提取厚壳贻贝多糖收率的影响顺序为CBDA，温度和pH值是主要影响因素。通过正交试验确定的最优水平为A3B3C2D1，即提取温度60 ℃、pH 10、料液比1：20、加酶量0.5%。

通过两种方法比较，两步联合酶解法的效果更佳，联合酶解方法要高于单独采用木瓜蛋白酶或胰蛋白酶解多糖。两种蛋白酶能有效酶解多糖结合的蛋白质，从而将多糖释放出来而提高多糖的得率，同时降低了多糖中蛋白质的含量，大大的提高了多糖的纯度。在正交试验最优条件下，即木瓜蛋白酶为提取温度60 ℃、pH 7、料液比1：30、加酶量1%；胰蛋白酶为提取温度60 ℃、pH 10、料液比1：20、加酶量0.5%，取贻贝粉末1 g进行放大提取，重复3 次。结果贻贝粗多糖3 次得率分别为 24.08%、23.25%、23.78%。由此可知，联合酶提取粗多糖的产率约为23.69%。

2.2 粗多糖的理化性质分析

热水提取和两步联合酶解粗多糖的总糖、蛋白、糖醛酸、硫酸根的含量测定结果如表2所示。从表2可以看出，RT粗多糖的总糖含量为72.38%，MT粗多糖的总糖含量为86.08%，相差不大。RT粗多糖的糖醛酸和蛋白含量明显低于MT粗多糖，而硫酸根含量几乎相同。可知两步联合酶解法能更好的除去残留蛋白质和各种小分子，提高多糖的得率。

表3 RT粗多糖和MT粗多糖的理化性质测定Table3 Physiochemical of RT crude polysaccharides and MT crude polysaccharides

2.3 贻贝粗多糖的分离和纯化

采用弱离子交换层析法对贻贝多糖进行分离纯化。样品经水洗（2 倍体积水）和0～2 mol/mL的NaCl初步线性洗脱后，依此选用纯水、0.05、l mol/L的NaCl溶液进行梯度洗脱。结果如图1可知，热水提和酶提粗多糖均得到3 种组分，分别经透析脱盐、冷冻干燥后得RT1、 RT2、RT3和MT1、MT2、MT3。其中RT1，RT2为白色粉末，RT3为淡黄色粉末。对于前两种组分，不同的提取方法对其含量影响不大，但是对于l mol/L NaCl溶液洗脱组分RT3和MT3，酶提MT3组分比热水提多糖RT3显著提高，二者纯化后得率分别为13.5% 和5.13%。由分离纯化结果可知，热水提取后酶解不仅可以提高多糖的得率和纯度，还可明显提高l mol/L NaCl溶液洗脱组分的含量。

2.4 柱前衍生HPLC法测定贻贝单糖组成

采用PMP柱前衍生HPLC法对纯化后多糖组分进行单糖组成分析，通过与10 种单糖标准品的色谱图（图2）的出峰时间相比较，确定各组分的单糖组成。

图2 PMP标准品的柱前衍生液相色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of pre-column derivatives of monosaccharide standards

结合样品中各单糖的峰面积和标准曲线，由图2～5可知，RT粗多糖的单糖以葡萄糖（Glc）为主，还含有少量的甘露糖（Man）、氨基葡萄糖（GlcN）、葡萄糖醛酸（GlcUA）、半乳糖（Gal）和岩藻糖（Fuc）。MT单糖组成的种类与RT多糖相同，并且同样以Glc为主，但是Glc的含量大大降低，其他单糖组成比例明显上升。结合分离纯化的结果，可以推测RT和MT单糖组成的差异可能由组分3的含量差异造成的。所以对组分3进行单糖组成分析表明，该组分以杂多糖为主，Man、GlcN、GlcUA、Gal和Fuc均升高，几乎不含有葡萄糖。由此可见热水提取后联合酶提方法可促进了贻贝类糖胺聚糖的释放，提高其得率，由于类糖胺聚糖离子强度高，所以在高浓度的l mol/L NaCl溶液洗脱下来。得到各单糖的物质的量比如表4所示。

图3 RT多糖的柱前衍生液相色谱图Fig.3 HPLC chromatogram of pre-column derivatives of RT

图4 MT多糖的柱前衍生液相色谱图Fig.4 HPLC chromatogram of pre-column derivatives of MT

图5 MT3的柱前衍生液相色谱图Fig.5 HPLC chromatogram of pre-column derivatives of MT3

表4 组分各单糖物质的量比Table4 Monosaccharide composition of RT and MT crude polysaccharides and MT3

2.5 粗贻贝多糖分子质量分布范围测定

动物多糖分子质量的测定是研究多糖性质的一项重要的工作，多糖的性质往往与分子质量大小有关。采用Shodex OH pak SB-804 HQ凝胶色谱柱测定相对分子质量。由图6可以看出，RT多糖出现两个组分，出峰的时间分别为11.241 min和16.183 min，主要以11.241 min 时峰最高。而MT多糖在11.23 min 时出峰的组分明显减少，在16.18 min时峰明显升高。MT3时间在15.110 min和17.053 min，主要组分大大增加，主要以第2个组分为主。由分子质量测定结果同样可以说明酶提可提高类聚糖胺聚糖的含量。并且可知贻贝多糖主要含有两种组分，一种组分以高分子质 量的葡聚糖为主，分子质量约为669 kD，另一种以类糖胺聚糖为主，分子质量要小得多，约为18 kD。

图6 RT、MT和MT3的高效液相渗透色谱图Fig.6 High performance liquid permeation chromatogram of RT, MT and MT3

2.6 红外光谱分析结果

图7 MT、RT和MT3的红外光谱图Fig.7 IR spectra of MT, RT and MT3

MT、RT、MT3的红外光谱如图7所示，酶法提取所得多糖红外光谱、直接热水提取法所得多糖红外光谱和MT3的红外光谱基本一致，两种方法所得多糖应有相似的生物活性。是典型的多糖结构图谱，体现了多糖的特征吸收。在3 403 cm-1处强吸收峰为羟基（—OH）的伸缩振动，微量水分子缔合羟基；2 931 cm-1处为C—H的伸缩振动。1 647 cm-1吸收峰处为是羧基（C=O）伸缩振动，微量水分子缔合羟基造成[21]。1 417、1 385 cm-1吸收峰为C—H的变角振动。1 153、1 080、1 022 cm-1处吸收峰为吡喃糖苷特征吸收峰。852 cm-1为吡喃糖环α型C—H键变角振动的特征峰；933 cm-1为α-D-吡喃葡萄糖的吸收峰。

2.7 厚壳贻贝多糖抗氧化活性结果

为确定不同提取方法对活性的影响，对热水提和酶提粗多糖进行抗氧化活性研究。在体外抗氧化评价指标中，热水提和酶提粗多糖均表现出一定的抗氧化活性，随着多糖质量浓度的升高，抗氧化活性也随着增强，抗氧化能力与多糖质量浓度呈现正相关（图8）。总体来说，酶提多糖的抗氧化活性均要优于热水提多糖。

在多糖质量浓度为10 mg/mL时，DPPH自由基的清除率分别为MT多糖为84.18%，RT多糖为80.01%。MT多糖和 RT多糖对DPPH自由基清除的半最大效应浓度（concentration for 50% of maximal effect，EC50）分别为 3.75 mg/mL和4.97 mg/mL 。两者清除超氧阴离子自由基效果相当，MT多糖对超氧阴离子自由基的清除效果稍微好些，二者对超氧阴离子自由基清除的EC50分别为5.01 mg/mL和6.48 mg/mL 。

在抗脂质过氧化的指标中，MT多糖抗脂质过氧化的活性比RT多糖要强。在10 mg/mL时，二者对脂质过氧化物的清除率分别为 82.33% 和76.01%。MT多糖和RT多糖对脂质过氧化物清除的 EC50分别为2.41 mg/mL和3.46 mg/mL。

在多糖还原力测定中，与VC对比，虽然还原力呈增强趋势，但活性低很多。总体说MT多糖比RT多糖的还原力要高一些。

图8 热水提和酶提粗多糖的抗氧化活性研究Fig.8 Antioxidant activity of RT and MT

体外抗氧化实验表明，提取方法对多糖的生物活性也会产生影响，热水提取后酶提的抗氧化活性要优于热水提多糖。而酶提粗多糖中类糖胺聚糖含量高，推测贻贝多糖中类糖胺聚糖表现出更优良的抗氧化活性[22]。由于纯化多糖含量有限，未对类糖胺聚糖进行单独的抗氧化实验，其体内外抗氧化活性将继续进行后续的研究。

2.8 抗肿瘤活性贻贝粗多糖的初步测定

图9 不同酶解粗多糖对DU-145细胞的增值抑制率Fig.9 Inhibitory activity of MT1, 2 and 3 against DU-145 cells

和抗氧化活性一样，对不同提取方法得到的多糖进行体外抗肿瘤活性研究。MT、RT在质量浓度为20 mg/mL，作用48 h后，对DU-145细胞增值抑制率分别为78.50%和59.80%。由于MT的抗肿瘤活性最强，为追踪并确定其抗肿瘤成分，故对MT经过离子交换柱分离得到的3 个组分，即MT1、MT2、MT3进行抗肿瘤活性研究，结果见图9。各组分在质量浓度为5 mg/mL，对DU-145细胞作用48 h后，增值抑制率分别26.38%、25.11%和86.43%，其中MT3抗肿瘤活性最强，要远远优于其他两个组分，说明类糖胺聚糖为贻贝多糖中主要的抗肿瘤成分[23]。

为测定MT3对DU-145细胞的增值抑制作用，将MT3配制成5 个不同质量浓度组，分别测定作用 24、48h 和72 h后，对前列腺癌细胞株DU-145增殖的影响。如表5所示，当质量浓度为8 mg/mL ，作用72 h后，MT3对DU-145细胞增值抑制率为86.25%。DU-145细胞的IC50，24 h为2.96 mg/mL；48 h为2.71 mg/mL；7 h为2.75 mg/mL。实验表明，MT3对细胞的增值抑制作用随质量浓度增大而增强，呈现时效和量效关系。

表5 MT3 对 DU-145 细胞的增值抑制率（±s，n=3）Table5 Inhibitory effect of MT3 on proliferation of DU-145 cellsx =3)

表5 MT3 对 DU-145 细胞的增值抑制率（±s，n=3）Table5 Inhibitory effect of MT3 on proliferation of DU-145 cellsx =3)

注：*.与同种细胞最小抑制率比较，差异显著（P＜0.05）；**.与同种细胞最小抑制率比较，差异极显著（P＜0.01）。

组别抑制率/% 24 h48 h72 h对照组 ——0.5 mg/mL 30.38±2.036.33±2.429.20±1.5* 1.0 mg/mL34.78±1.940.87±2.3**43.25±2.0 2.0 mg/mL45.13±2.0*49.87±1.8* 48.75±1.8 4.0 mg/mL64.25±2.867.18±1.968.44±1.6** 8.0 mg/mL83.75±1.2*86.15±2.7** 86.25±1.7*

3 讨 论

经过热水提取和热水提取后两步酶解法比较后，采用两步联合酶解法提取厚壳贻贝多糖，研究了酶法的提取时间、液料比、pH值、温度对贻贝多糖得率的影响规律。厚壳贻贝多糖的得率得以提高主要是联合酶将贻贝中的多糖物质充分溶解释放出来，在提高贻贝多糖的得率的同时降低了蛋白质的含量，同时增大了多糖的纯度，简化了多糖的纯化工作，保持了多糖物质的生物活性。因此两步联合酶解法具有能力强且操作简单、耗时短及蛋白水解效率高的优点，并且可以在食品生产过程中与酶解多肽产品联合生产，简化生产工艺，促进贻贝产品的开发。与赵巧灵等[24]研究贻贝多糖提取分离结果比较，其贻贝贝肉经热水提取后粗多糖得率为19.03%。说明经过热水提取后两步酶解法得到的贻贝粗多糖（得率 23.69%）大大的提高其产率和产量。

通过DEAE-Cellulose 52离子交换柱层析进行初步分离纯化、单糖组成分析和分子质量的测定样品结果表明，不同的提取方法对多糖的成分产生影响。两步联合酶解法得到的粗多糖类糖胺聚糖的含量要明显高于热水提组分，单糖组成以Man、GlcN、GlcUA、Gal和Fuc为主，分子质量约18 kD。

通过体外抗氧化活性实验可知两种提取方法获得的多糖对羟基自由基、超氧阴离子自由基有一定的清除能力，并且有一定的总体还原能力和抗脂质过氧化能力。两步联合酶提获得的贻贝多糖的体外抗氧化能力优于热水提多糖，推测可能类糖胺聚糖是贻贝多糖抗氧化的主要成分。通过与殷秀红[25]等研究贻贝多糖体外抗氧化活性研究比较，发现经水提和酶提的贻贝多糖在相同质量浓度（10 mg/mL）对DPPH自由基清除率分别为11.73%和39.14%均低于两步联合酶提获得的贻贝多糖。

在抗肿瘤活性研究中，选择经典的MTT法实验也确定类糖胺聚糖是贻贝多糖抗肿瘤的主要成分。酶解的MT3组分的体外抗肿瘤活性要远远优于水洗的组分。结果表明贻贝多糖能直接抑制肿瘤细胞活性，其抗肿瘤机制及是否可以通过调节免疫系统而达到抗肿瘤作用尚需要进一步研究。在贻贝多糖的抗肿瘤活性研究中首次研究对前列腺癌细胞DU-145的抑制活性，比较发现其在相同浓度下对前列腺癌细胞抑制活性明显优于人卵巢癌细胞HO-8910（抑制率30.55%）、人红白血病细胞K562（抑制率15.62%）、人肝癌细胞SMMC-7721（抑制率8.42%）。说明贻贝多糖对前列腺癌细胞的抑制效果更好，提示可对贻贝多糖进行深入的体内抗前列腺癌研究，以期用于前列腺癌的辅助治疗。

厚壳贻贝来源丰富，但还未被充分开发利用，具有广阔的开发前景。通过系统的提取工艺优化和以抗氧化和抗肿瘤为主的活性追踪确定类糖胺聚糖是厚壳贻贝主要的活性多糖成分，确定了类糖胺聚糖的优化提取方法和工艺，为开发利用贻贝资源，深入研究海洋动物多糖的药用价值奠定基础。

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Optimized Extraction and Bioactivity in vitro of Polysaccharides from Mytilus coruscus

ZHONG Cheng-cheng1, QU You-le2,*, CHEN Yin2
(1. College of Food and Pharmacy, Jiamusi University, Jiamusi 154007, China; 2. College of Food and Pharmacy, Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316000, China)

Antioxidant, antitumor polysaccharides were prepared from Mytilus coruscus muscle by hot water extraction alone or followed by sequential hydrolysis with papain and trypsin, and analyzed for physiochemical properties. After chromatographic purification on a DEAE-Cellulose 52 column, the antioxidant and antitumor activities in vitro were investigated. Combined enzymatic hydrolysis, giving rise to a yield of crude polysaccharides of 23.69%, was advantageous over single enzymatic hydrolysis and hot water extraction as far as the yield, purity and bioactivity of crude polysaccharides were concerned. The in vitro antioxidant activity of crude polysaccharides obtained from combined enzymatic hydrolysis showed a concentration for 50% of maximal effect (EC50) of 3.75, 5.01 and 2.41 mg/mL in scavenging DPPH, superoxide anion and lipid peroxide radicals, respectively, and an IC50of 2.93 mg/mL against the growth of prostate cancer cells DU-145 cultured for 48 h. Analysis of the yield and chemical composition of purifi ed polysaccharide fractions indicated that higher contents of glycosaminoglycan-like polysaccharide (MT3) with a molecular weight of roughly 18 kD in crude polysaccharides were obtained by combined enzymatic hydrolysis and the monosaccharide composition consisted of Man, GlcN, GlcUA, Gal and Fuc. Meanwhile, MT3 was more effective against tumor cells DU-145 in vitro with an IC50of 2.71 mg/mL after 48 h of culture in its presence. The results of activity-guided separation demonstrated that combined enzymatic hydrolysis after hot water extraction could not only increase the purity of polysaccharides through protein degradation, but could signifi cantly enhance the content of glycosaminoglycans as well, and glycosaminoglycans were the main active polysaccharides in Mytilus coruscus muscle that possessed good antitumor activity.

Mytilus coruscus; polysaccharide; extraction process; antioxidant; antitumor

R961

A

1002-6630（2014）10-0107-08

10.7506/spkx1002-6630-201410020

2013-09-12

浙江海洋学院校级专项科研项目（X122X01）

钟城城（1985—），女，硕士研究生，研究方向为药物化学。E-mail：zhong102456@sina.com

*通信作者：曲有乐（1960—），男，教授，学士，研究方向为天然产物活性研究、结构改造与设计。E-mail：youle1960@163.com