响应面法优化酶辅助闪式提取二氢槲皮素工艺

柴 婧，付警辉，张卫鹏，郑毅男，刘文丛

（吉林农业大学中药材学院，吉林 长春 130118）

响应面法优化酶辅助闪式提取二氢槲皮素工艺

柴 婧，付警辉，张卫鹏，郑毅男，刘文丛*

（吉林农业大学中药材学院，吉林 长春 130118）

目 的：利用响应面法对纤维素酶辅助闪式提取二氢槲皮素的工艺条 件进行优化。方法：以二氢槲皮素的提取率为指标，在单因素试验的基础上，应用Box-Behnken试验设计，对影响提取率的条件（乙醇体积分数、加酶量和液料比）进行 优化。结果：最佳提取条件为乙醇体积分数60.93%、加酶量3.48 mg/g、液料比103.64：1（mL/g）、提取时间120 s。结论：闪式提取操作简便、节能、省时，可应用于二氢槲皮素大规模生产。

长白落叶松；二氢槲皮素；纤维素酶；闪式提取；响应面分析法

二氢槲皮素又名花旗松素、紫杉叶素、黄杉素、双氢栎精等，化学名为5,7,3’,4’-四羟基二氢黄酮醇，分子式为C15H12O7，相对分子质量为304.25。二氢槲皮素广泛存在于落叶松、水红花、刺玫蔷薇等60 余种植物当中[1-2]，其具有很多生物学活性，如抗病毒[3]、抗氧化[4]、抗癌、抑制恶性肿瘤细胞生长[5]、调节酶活性[6]、防晒美白[7]、治疗恶性淋巴细胞病变[8]等，因此被广泛应用于食品、药品、化妆品、工业、农业等多个领域[9]。

大部分植物的细胞壁都是纤维素构成，其有效成分往往被包裹在细胞壁内。纤维素酶广泛的应用于植物的提取工艺中，它可以破坏植物的细胞壁，使构成植物细胞壁等不易利用的植物纤维分解成葡萄糖，从而有利于有效成分从植物中溶出[10-12]。闪式提取法是应用闪式提取器，利用植物组织破碎原理从而使有效成分从植物体中大量溶出的一种提取方法，具有快速、简便、不需加热等特点，可以节约大量的时间和能源，适合大规模工业生产[13-15]。

目前，落叶松中二氢槲皮素的提取方法及工艺优化主要有浸渍法[16]、回流提取法[17]、有机溶剂萃取法[18-20]、超声提取法[21]、微波辅助提取法[22-23]、沉淀分离法[24-25]等，每种提取方法都存在着各自的优缺点。而用纤维素酶预处理后采用闪式提取长白落叶松中二氢槲皮素的方法鲜有研究。本研究以长白落叶松为原料，用纤维素酶预处理后，用闪式提取器提取长白落叶松中的二氢槲皮素，采用响应面分析法，根据Box-Behnken试验设计原理，对提取工艺条件进行优化。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

落叶松取材于吉林省临江市，由吉林农业大学郑毅男教授鉴定为松科（Pinaceae）落叶松属（Larix）植物长白落叶松（Larix olgensis Henry var. koreana Nakai）。二氢槲皮素对照品（≥87.5%） 美国Sigma公司；乙醇、甲酸（均为分析纯） 北京化工厂；甲醇（色谱纯） 美国Tedia公司；纤维素酶 广州苏柯汉微生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

JHBE-50S闪式提取器 河南金鼎科技有限公司；BP211D型电子天平 德国Sartorius公司；DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司；FW400A高速万能粉碎机 北京科伟永兴仪器有限公司；LC-2010A高效液相色谱仪（配有LC solution工作站、SPD-20A紫外检测器） 日本岛津公司；SZ-93自动双重水蒸馏器 上海亚荣生化仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 二氢槲皮素高效液相色谱检测方法

1.3.1.1 对照品溶液的制备

精密称取二氢槲皮素对照品50 mg，用甲醇-水（2：3，V/V）定容于50 mL容量瓶中，分别移取0.5、1、4、6、8、10 mL对照品溶液于10 mL容量瓶中，用甲醇-水（2：3）定容至刻度，得质量浓度分别为0.044、0.088、0.35、0.525、0.7、0.875 mg/mL的对照品溶液。

1.3.1.2 供试品溶液的制备

取过30 目筛后的干燥长白落叶松粉末10 g，加入60%乙醇1 000 mL，闪式提取一次，时间为120 s，过滤，减压回收溶剂，用甲醇-水（2：3）定溶于250 mL容量瓶中，使用0.22 μm微孔滤膜过滤，备用。

1.3.1.3 色谱条件

色谱柱：C O S M O S I L 5 C18-M S-Ⅱ（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相：甲醇-1‰甲酸溶液（35：65，V/V）；流速1 mL/min；检测波长288 nm；柱温30 ℃；进样量20 μL。

1.3.1.4 标准曲线的绘制

将1.3.1.1节制备的对照品溶液进行含量分析。以二氢槲皮素对照品的质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3.1.5 精密度

精密吸取1.3.1.1节所制备对照品溶液20 μL，连续分析5次，测定峰面积，考察方法的精密度。

1.3.1.6 重复性

精密称取过筛后长白落叶松干燥粉末5份，每份10 g。按1.3.1.2节方法制备供试品溶液进行分析，测定峰面积，考察方法的重复性。

1.3.1.7 稳定性

取1.3.1.2节供试品溶液，分别于0、1、2、4、8、10 h进行分析，测定峰面积，考察方法的稳定性。

1.3.1.8 回收率

精密称取5 份二氢槲皮素含量为19.08 mg/g的的长白落叶松树材木屑（过30 目筛）10 g，加入二氢槲皮素对照品溶液10 mL（质量浓度分别为4.4、3.5、2.6 mg/mL），按1.3.1.2节方法制备供试品溶液后测定。

1.3.2 二氢槲皮素提取工艺的优化

1.3.2.1 单因素试验

将烘干后长白落叶松粉碎，过30 目筛，取10 g过筛后木屑，加入一定量的纤维素酶和蒸馏水，用缓冲液调pH值至5，55 ℃水浴2 h，100 ℃灭活10 min。加入一定量的乙醇，进行闪式提取，提取1 次，过滤，减压浓缩，用甲醇-水（2：3）定溶于250 mL容量瓶中，使用0.22 μm微孔滤膜过滤后测定含量，计算出二氢槲皮素提取率（每g干燥长白落叶松木屑所能提取出的二氢槲皮素质量/mg）。以二氢槲皮素的提取率为指标，选取乙醇体积分数（40%、50%、60%、70%、80%）、闪式提取时间（60、90、120、150、180 s）、加酶量（1、2、3、4、5 mg/g）和液料比（60：1、80：1、100：1、120：1、140：1）（mL/g）进行单因素试验。

1.3.2.2 响应面分析试验

综合单因素试验结果，应用响应面分析法对提取工艺参数进行优化。选取对二氢槲皮素提取率影响较大的3个因素：乙醇体积分数、加酶量和液料比。通过Design Expert 8.0软件，根据Box-Behnken试验设计原理，对提取工艺进行响应面分析。分析因素和水平设计如表1所示。

表1 响应面分析试验因素与水平Table1 Factors and levels used in response surface analysis

2 结果与分析

2.1 二氢槲皮素高效液相色谱图及方法评价结果

由如图1可知，二氢槲皮素的保留时间为7.8 min左右。方法的线性回归方程为Y=21 878 879.12X-1 951 064.44，R2=0.999 7，线性范围0.044～0.875 mg/mL，计算得长白落叶松树材木屑中二氢槲皮素平均含量为19.06 mg/g，与已知含量19.08 mg/g接近；本方法的精密度、重复性良好（RSD分别为1.3%、2.6%）；10 h内稳定性良好（RSD为1.9%）；平均加样回收率（n=9）为99.2%，RSD为2.5%。表明该方法适于二氢槲皮素的测定。

图1 二氢槲皮素对照品（A）和供试品（B）高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of dihydroquercetin standard (A) and sample from pine wood chips (B)

2.2 单因素试验

2.2.1 乙醇体积分数对二氢槲皮素提取率的影响

固定闪式提取时间120 s、加酶量3 mg/g、液料比70：1（mL/g），考察乙醇体积分数对二氢槲皮素提取率的影响。由图2可知，随着乙醇体积分数的升高，二氢槲皮素的提取率也随之增加，当乙醇体积分数达到60%时，二氢槲皮素的提取率达到最高，这是因为二氢槲皮素难溶于水，易溶于乙醇，随后又随着乙醇体积分数的增加而降低。因此，Box-Behnken试验选取的乙醇体积分数的范围为50%～70%。

图2 乙醇体积分数对二氢槲皮素提取率的影响Fig.2 Effect of ethanol concentration on the yield of dihydroquercetin

2.2.2 闪式提取时间对二氢槲皮素提取率的影响

固定乙醇体积分数50%、加酶量3 mg/g、液料比70：1（mL/g），考察闪式提取时间对二氢槲皮素提取率的影响。由图3可知，虽然在150 s时，提取率有所降低，但所考察提取时间范围内二氢槲皮素的提取率并没有显著变化，因此在响应面优化试验中不再作为考察因素。

图3 闪式提取时间对二氢槲皮素提取率的影响Fig.3 Effect of extraction time on the extraction yield of dihydroquercetin

2.2.3 加酶量对二氢槲皮素提取率的影响

固定乙醇体积分数50%、闪式提取时间120 s、液料比70：1（mL/g），考察加酶量对二氢槲皮素提取率的影响。由图4可知，随着加酶量的增加，二氢槲皮素的提取率有所增加，在加酶量为3 mg/g时达到最大值，随后又随着加酶量的增加而有所降低，纤维素酶的用量应和落叶松木屑质量形成一定的比例才能发挥纤维素酶的最佳作用。因此，Box-Behnken试验选取的加酶量的范围为2～4 mg/g。

图4 加酶量对二氢槲皮素提取率的影响Fig.4 Effect of cellulase concentration on the extraction yield of dihydroquercetin

2.2.4 液料比对二氢槲皮素提取率的影响

图5 液料比对二氢槲皮素提取率的影响Fig.5 Effect of liquid-to-material ratio on the extraction yield of dihydroquercetin

固定乙醇体积分数50%、闪式提取时间120 s、加酶量3 mg/g，考察液料比对二氢槲皮素提取率的影响。由图5可知，随着液料比的增加，二氢槲皮素的提取率增加，在液料比达到100：1（mL/g）时，二氢槲皮素的提取率达到最大值，随着液料比继续增加，二氢槲皮素的提取率趋于平稳，液料比的增加，可使落叶松木屑充分的与溶剂接触，使有效成分快速溶解到溶剂中。因此Box-Behnken试验选取的液料比的范围为80：1～120：1（mL/g）。

2.3 响应面优化工艺条件

试验设计及结果见表2，试验号1～12为析因试验，试验号13～17为中心试验。以二氢槲皮素提取率（Y）为响应值，各因素经回归拟合后，得二次多项回归方程为：

Y=23.22-0.026A＋0.29B＋0.10C＋0.06AB＋0.13AC＋0.067BC-0.14A2-0.32B2-0.41C2

表2 Box-Behnken试验设计方案及结果Table2 Design and results of Box-Behnken experiments

表3为回归模型方差分析结果，该模型回归显著（P＜0.000 1），R2=0.991 7，失拟项不显著，说明该模型与实际实验拟合程度较好，可以用于二氢槲皮素提取的预测。从F值的分析结果（A（F=2.06）、B（F=257.65）、C（F=32.92））可以看出，在所选的各因素水平范围内，对二氢槲皮素提取率影响大小的顺序为：加酶量＞液料比＞乙醇体积分数。

从图6可以看出，图中均存在极值，即响应面的最高点，说明试验所选范围较合理。从图6A可以看出，加酶量对二氢槲皮素提取率的影响较大，而乙醇体积分数相对较为平缓，说明乙醇体积分数对提取率的影响较小，两者交互作用较弱。由图6B可知，液料比的响应面变化更明显、变化范围更大；相反，乙醇体积分数变化较为平缓，从液料比的等高线与坐标轴的交点较多也可以看出液料比对二氢槲皮素的影响较大，等高线为椭圆形，极值对应的点接近椭圆形的中心，说明两因素有很强的交互作用。从图6C可以看出，加酶量相对于液料比对提取率的影响更大，并且两者有一定的交互作用，但等高线几乎为圆形，说明作用不是很强。

表3 回归模型方差分析结果Table3 Analysis of variance for the fitted regression model

图6 各因素交互作用的响应面图Fig.6 Response surface plots for the effects of three process conditions on the extraction yield of dihydroquercetin

2.4 提取工艺条件的确定

结合回归模型分析结果可知，酶辅助闪式提取二氢槲皮素的最佳工艺条件为乙醇体积分数60.93%、加酶量3.48 mg/g、液料比103.64：1（mL/g）、提取时间120 s。考虑到实际操作的可行性，将最优提取工艺调整为乙醇体积分数61%、加酶量3.5 mg/g、液料比104：1（mL/g）、提取时间120 s，实验重复3 次，在此条件下二氢槲皮素的理论提取率为23.30 mg/g，实际提取率为23.22 mg/g。因此，响应面分析法所优化的最佳提取工艺数据真实可靠，可应用到酶辅助闪式提取二氢槲皮素的实际生产中。

3 结 论

应用响应面分析法对酶辅助闪式提取二氢槲皮素的提取工艺进行研究，采用合理的实验设计，对提取工艺进行全面的剖析和评测，从而得到二氢槲皮素的最佳提取工艺：乙醇体积分数60.93%、加酶量3.48 mg/g、液料比103.64：1（mL/g）、提取时间120 s。应用此条件，二氢槲皮素的理论提取率为23.30 mg/g，实际提取率为23.22 mg/g。实际值与理论值基本相符，证明试验模型可靠。将纤维素酶应用到二氢槲皮素的提取，可以大幅度的提高提取率，闪式提取方法简便、节能、省时，可应用于二氢槲皮素的提取和生产。

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Optimization of Cellulase-Assisted Extraction of Dihydroquercetin by Response Surface Methodology

CHAI Jing, FU Jing-hui, ZHANG Wei-peng, ZHENG Yi-nan, LIU Wen-cong*
(College of Traditional Chinese Medicine, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

Objective: To optimize the celluase-assisted extraction of dihydroquercetin from Larix olgensis Henry var. koreana Nakai wood chips by response surface methodology (RSM). Methods: Dihydroquercetin was extracted with ethanol in a herbal blitzkrieg extractor from pine wood chips pre-hydrolyzed with celluase. On the basis of the results of single-factor experiments, a Box-Behnken design was performed to optimize three extraction conditio ns including ethanol concentration, enzyme dosage and liquid-to-solid ratio. Results: The optimal extraction conditions were determined as hydrolysis with an enzyme dosage of 3.48 mg/g and subsequent extraction for 120 s with 60.93% ethanol in water at a liquid-to-solid ratio of 103.64:1 (mL/g). Conclusion: The proposed extraction procedure can provide a simple, energy-saving and time-saving way for massive production of dihydroquercetin.

Larix olgensis Henry var. koreana Nakai; dihydroquercetin; cellulase; extraction; response surface methodology (RSM)

R931.6

A

1002-6630（2014）10-0093-05

10.7506/spkx1002-6630-201410017

2013-07-30

吉林省科技厅项目（20115064）

柴婧（1988 —），女，硕士研究生，研究方向为天然产物化学。E-mail：chaijing880426@qq.com

*通信作者：刘文丛（1968—），男，教授，博士，研究方向为天然产物化学。E-mail：jwlw6803@126.com