微波法辅助反胶束技术前萃取大豆蛋白工艺

赵晓燕，陈 军，王宪昌，陈相艳，邓 鹏，林 洋

（山东省农业科学院农产品研究所，山东 济南 250 100）

微波法辅助反胶束技术前萃取大豆蛋白工艺

赵晓燕，陈 军，王宪昌，陈相艳*，邓 鹏，林 洋

（山东省农业科学院农产品研究所，山东 济南 250 100）

以全脂大豆为研究对象，为提高反胶束前萃取大豆蛋白的效率，利用变频微波萃取仪，辅助反胶束技术前萃取大豆蛋白。研究单因素即提取温度、pH值、液料比与时间对大豆蛋白提取率的影响，通过主要因素的响应面试验，优化提取参数，且检测了参数之间相互作用关系。利用统计分析和优化，结果显示，微波对前萃取大豆蛋白影响的相对大小依次为提取时间＞温度＞pH值。结果表明：在提取温度43.3 ℃、pH 8、萃取时间23 min时，蛋白质前萃率达到最高水平，提取率80.61%。

大豆蛋白；反胶束；微波；前萃；响应面法

大豆是一种古老的食品，大豆蛋白属于植物性蛋白含有8种人体必需氨基酸，且比例较合理、含量较高，品质优于粮食蛋白质，与肉类的蛋白质接近，为植物性的完全蛋白质，且在众多的植物性蛋白质中营养价值最高，在日常生活中被人们广泛利用。另外大豆蛋白不仅具有营养价值还具有保健作用，能降低胆固醇水平而维护心血管健康等[1]。

大豆蛋白的提取方法有碱提酸沉法、膜分离方法与双水相萃取技术等[2-4]。目前工业化生产的基本方法为碱提酸沉法，但该方法耗酸、耗碱量大，造成环境的污染与蛋白的变性；而其他方法的研究仍处于实验室阶段，没有工业化应用。反胶束技术作为一种新的分离技术，由表面活性剂的极性头（亲水基）朝内，非极性尾（疏水基）朝外排列组成，形成一个球状的极性核，核内是一定数量的水，称为微水池或者微水相，该水池可以增溶蛋白质、酶等可溶性极性物质[5-8]。

近年来反胶束溶液作为新的溶剂系统萃取生物分离技术已广泛应用于蛋白质的溶液萃取中，该方法成本低，溶剂可回收利用，萃取效率高，选择性高，使用范围广，操作简单等优点，为蛋白质和油脂的提取分离提取开辟了一条具有工业发展的途径[9-10]。因此，反胶束技术制备蛋白质是前景看好的生产工艺路线，已成为近年来国际上蛋白生产的研究热点。

当反胶束溶液与蛋白质水溶液或含蛋白质的固相接触后，蛋白质可加溶于反胶束溶液的过程，称为前萃；将含有蛋白质的反胶束溶液转移至第2水相的过程，通过调节pH值与离子强度等，使蛋白质转入水相、离心分离，从而分离出蛋白质，称为后萃[9-11]。国内20世纪80年代引进了反胶束的概念，开始了对反胶束的研究，之后国内陆续有反胶束萃取氨基酸、蛋白质、酶的报道[12-13]，随后开展了反胶束技术同时分离蛋白与油脂的研究，并取得了较好的效果[14-15]。在反胶束前萃取植物蛋白时，与其他技术相结合的研究也相继出现，如与超声波技术相结合前萃取植物蛋白[16]。但是，微波辅助反胶束技术前萃植物蛋白研究还鲜有报道。反胶束体系核内是一定数量的水，而水是吸收微波的最好介质。因此，反胶束与微波技术相结合萃取蛋白，在蛋白制备工业化应用中是非常有意义的集成技术。

变频微波萃取仪利用非接触红外测温，通过微波功率自动变化，来保持温度的恒定，而普通的微波仪随着时间的延长，温度快速上升。本实验在前人研究的基础上，采用该设备，辅助二（2-乙基已基）丁二酸酯磺酸钠（bis(2-ethylhexyl)sodium sulfosuccinate，AOT）正己烷反胶束体系前萃取大豆蛋白，改进工艺条件，研究了微波温度、缓冲溶液pH值、液料比与时间影响大豆蛋白的提取率，采用响应面试验，建立萃取数学模型，进行条件优化，得出大豆蛋白提取率较高的较优提取条件。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆来自山东济南（中豆25号），将大豆晾干，磨成豆粉，过100目筛，封口备用；AOT 上海联民化工厂；正己烷、卡尔费休试剂与氯化钾等化学试剂为分析纯 上海国药集团。

1.2 仪器与设备

MAS-ІІ型常压微波萃取反应仪 上海新仪微波化学科技有限公司；AFK-1B水分自动测定仪 上海禾工科学仪器有限公司；K9860凯式定氮仪、SH220消化炉美国海能公司；SH-3磁力搅拌器 北京金紫光科技发展有限公司；移液枪 Eppendorf公司；CR22DⅢ高速冷冻离心机 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 AOT反胶束溶液的配制

分别称取一定量的AOT表面活性剂置于锥形瓶中，加入一定体积的有机溶剂正己烷（反胶束相的质量浓度为0.08 g/mL，即1 mL正己烷中加入0.08 g的AOT），超声使表面活性剂完全溶解。加入0.05 mol/L的电解质的缓冲溶液（浓度为0.07 mol/L KH2PO4＋Na2HPO4缓冲液），振荡后静置，溶液透明则为反胶束体系，反之则不是。

1.3.2 大豆蛋白前萃率的计算

分别取30 mL配制好的反胶束溶液，根据1.3.1节实验结果分别加入0.05 mol/L的电解质的缓冲溶液，使各种反胶束溶液含水量值达到最大。然后加入一定量的全脂大豆粉（精确到0.000 1 g），在一定温度的微波萃取仪中提取一段时间，然后进行离心分离去除残渣。实现上清液中蛋白和油脂的同时分离，再用另一1 mol/L盐溶液水相后萃，蛋白被后萃出来，经精制、冷冻干燥得到大豆蛋白。由于表面活性剂遇冷即沉淀，油-异辛烷可先冷却到0～4 ℃，分离出表面活性剂，然后将油-有机溶剂相减压蒸馏，实现油脂和异辛烷两相分离（后萃数据未展示）。利用凯氏定氮法测定前萃液中的蛋白质含量，计算蛋白前萃率。

1.3.3 微波辅助反胶束前萃取大豆蛋白的单因素试验

取20 mL 0.08 g/mL AOT的反胶束溶液，加入1.8 mL含0.05 mol/L KCl缓冲液（pH 7.0），全脂大豆粉加入量为0.02 g/mL，在不同温度（30、35、40、45、50、55 ℃）与pH值（5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0）条件下，分别将0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 g的豆粉与反胶束溶液混合，在200 r/min下振荡5、10、15、20、30、40、50 min，然后在4 000 r/min的条件下离心10 min，离心分离得上清液，每个样重复测定3次，采用凯氏定氮法计算蛋白含量。

1.3.4 响应面试验

通过以上各因素试验，分别将微波提取温度、液料比与时间对萃取大豆蛋白的综合影响，采用DPS13.1数据处理系统设计三因素三水平Box-Behnken响应面试验，如表1所示，试验结果分析均在DPS数据处理软件下运行。

表1 Box-Behnken设计因子水平及编码Table1 Variables and coded levels for Box-Behnken Design

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

微波温度是影响反胶束萃取的一个重要因素，其关系如图1A所示。温度低于45 ℃之前，随着温度的升高，蛋白萃取率呈现上升趋势；温度超过45 ℃以后，随着温度的升高，蛋白萃取率呈现下降趋势。提取温度在45 ℃左右时为最适，说明优化实验温度条件应在45 ℃附近寻找。

微波萃取时，溶液的pH值对微波的萃取效率产生一定影响，针对不同的萃取样品，溶液有一个最佳的用于萃取的酸碱度。在图1B中，pH值达到7时，蛋白前萃率达到最大值，随着pH值的增大而减小，这与Göklen等[17]的研究结果是一致的。

图1 温度（A）、pH值（B）、样品加入量（C）和时间（D）对蛋白质前萃率的影响Fig.1 Effect of extraction time, pH, sample loading amount and extraction time on the forward extraction efficiency of soybean protein

样品加入量对蛋白前萃率的影响如图1C所示。在豆粉加入量小于0.6 g时，蛋白质前萃率随豆粉加入量增加而升高，在加入量为0.6 g左右时达到最大值，此后虽然豆粉加入量增加而前萃率却逐渐降低。综合考虑蛋白萃取率及生产成本的情况，为了在保证前萃率较高的前提下，又有较大的产量，样品添加量可选取在0.6 g左右。

微波萃取时间对蛋白萃取率的影响如图1D所示。蛋白质前萃率随提取时间的走势，呈先升高后降低的趋势，在提取时间少于20 min时前萃率随提取时间的延长而升高，在20 min左右时达到最大值，本实验选取20 min左右为提取最适时间。

2.2 Box-Behnken试验设计及结果

2.2.1 Box-Behnken试验结果及方差分析

根据单因素试验结果，选择微波温度、时间与pH值3个因素，采用Box-Behnken试验设计进行试验，实验方案与结果见表2。

根据试验结果进行方差分析由表3可知，拟合的二次多元方程的F值为46.473 3，说明用上述回归方程描述的因变量与全自变量之间的回归效果显著。从回归方程各项方差的进一步检验可以看出，失拟检验不显著F1=0.856 2＜F0.05（17,7）=3.49，试验误差小。此外，决定系数R2用来检查模型是否合适，其值为0.986 7，对大豆蛋白提取率来说，意味着98.67%样品变化归因于单变量，总变量中仅有1.33%不能通过模型来说明。数据证明该模型拟合程度良好，实验误差小，显著水平P＜0.05则可认为所选用的二次回归模型是恰当的。

表3 响应面模型的方差分析Table3 Analysis of variance for the developed regression model

通过多项式回归分析，各变量的回归系数、t值和P值如表4所示。由表4可知，温度（X1）对蛋白前率（Y）影响最显著，对蛋白前萃率影响强弱分别为温度＞时间＞pH值；且温度（X1）与pH值（X3）交互作用显著，温度（X1）与pH值（X3）的平方对蛋白前萃率（Y）影响显著。剔除不显著项后，得方程：Y=73.073 333-7.5675X1＋5.581 25X2＋8.583 75X3-27.556 666 67X12-21.244 166 67X32-5.392 5X1X3。

表4 回归系数及显著性检验Table4 Regression coefficients and statistical significance in the developed regression model

2.2.2 响应面图分析

从图2可以直观的分析两因子间的互作效应。当液料比与pH值一定时，蛋白前萃率随着萃取时间的延长和萃取温度的增加都是先增加后减小；图2的响应面图呈钟罩型，说明萃取温度和萃取时间的交互作用比较显著，这和表4的结果一致（交互项中X1X3的P值最小）。

图2 萃取温度（X1）与萃取时间（X3）互作效应图对蛋白前萃率的影响Fig.2 Response surface and contour plots for the effects of temperatures (X1) and times (X3) on protein forward extraction efficiency

2.2.3 因素水平优化组合及验证性实验

根据以上的优化试验，对回归方解求解，得到最佳优化条件组合为温度43.3 ℃、pH 8、提取时间23 min，在这些条件下，蛋白质的前萃率为80.61%，与理论值预测值81.01%的相对误差很小，而在无微波条件下，反胶束萃取大豆蛋白的前萃率约在65%左右，说明应用微波辅助反胶束技术提取大豆蛋白能有效的缩短提取时间、提高提取率。

3 讨 论

本实验采用变频微波辅助AOT-正己烷反胶束体系萃取全脂大豆粉中的大豆蛋白，在单因素试验中，温度过高会影响反胶束体系的稳定性，不利于蛋白质增溶。温度对蛋白质萃取影响主要在于3 个方面：一是温度升高可能导致渗透现象发生使反胶束结构破坏，造成蛋白质在水油两相中分配系数下降；二是温度升高时分子热运动加快使传质过程速率加快，进而萃取速率加快；三是温度对于蛋白质活性的影响，一般说来较低温度下有利于生物保持其活性温度过高会使其活性破坏[18]。萃取的最适温度由这3 个方面相互制约决定。值得注意一点是AOT为阴离子型表面活性剂，大豆蛋白的等电点大约为4.5，当缓冲液pH 7时，蛋白大量进入极性核内，蛋白前萃率较高，这说明大豆蛋白与阴离子型表面活性剂AOT分子之间的静电吸引力并不是影响反胶束萃取蛋白质的主要推动力[19]。当缓冲液pH 7时，大豆蛋白分子带负电，AOT阴离子表面活性剂反胶束体系的核内壁也是带负电，此时大豆蛋白分子却大量进入了极性核内，那么此种过程中蛋白进入反胶团内部的主要驱动力可能是离子交换机理，具体原理有待进一步实验研究。此外，样品的加入量过多，反而会影响前萃率，原因是反胶束溶液的聚集数增溶蛋白质的能力是有限的，导致样品量加入过多时，反胶束溶液增溶蛋白质的能力反而降低，蛋白质进入反胶束内核水池产生了竞争机制导致蛋白质含量会减少，当然也不排除会有别的原因[20]。

在单因素试验的基础上，通过响应面优化试验，建立影响影响蛋白质前萃率的温度（X1）、pH值（X2）、提取时间（X3）的条件优化模型：

Y=73.073 333-7.567 5X1＋5.581 25X2＋8.583 75X3-27.556 666 67-0.809 166 667-21.244 166 67-5.392 5X1X3＋3.375X2X3

因素对蛋白质前萃作用的大小顺序依次为：提取时间＞温度＞pH值，得出较优前萃条件为提取时间23 min、温度43.3 ℃、pH 8，在此条件下蛋白质前萃率最高优化指标为80.61%，与优化方案的理论值81.01%比较接近，证明优化后的条件是可靠的。与无微波的反胶束萃取的大豆蛋白相比，微波辅助萃取，时间缩短了约7 min，提取率了提高了约15%，暗示着微波辅助反胶束体系更有利于大豆蛋白前萃。因此，本研究可为大豆蛋白的研究开发及工业化生产提供理论基础。与相关的研究相比，研究虽然提高了前萃取率，但也存在一些不足之处，如表面活性剂与油相的分离等，本研究将进一步研究反胶束溶液对蛋白质的萃取，以提高大豆蛋白质前萃与后萃率，以提高蛋白得率，以及对蛋白液和油脂中表面活性剂的去除进行研究，并利用这一技术进行扩大应用实验。

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Microwave-Assisted Forward Extraction of Soy Protein in AOT/Hexane Reverse Micelles

ZHAO Xiao-yan, CHEN Jun, WANG Xian-chang, CHEN Xiang-yan*, DENG Peng, LIN Yang
(Institute Agro-Food Science and Technology, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250100, China)

A variable-frequency microwave-assisted method was applied in order to improve the forward extraction efficiency of soy protein in sodiumbis (2-ethylhexyl) sulfosuccinate (AOT) reverse micelles. The effects of experimental conditions such as temperature, pH value, the ratio of solution to material and extraction time on the extraction efficiency were examined. Response surface methodology (RSM) was used for modeling and optimizing the process to gain a better understanding of the process performance. By using RSM, the effects of temperature, pH value and extraction time on the extraction efficiency were calculated and their interactions were determined. After statistical analysis, the results showed that the effect of the extraction conditions followed the decreasing order: time ＞ temperature ＞ pH, and the optimum conditions were determined as follows: temperature 43.3 ℃, pH 8.0 and time 23 min, resulting in a yield of soy protein of 80.61%. This study showed that the variable-frequency microwave-assisted extraction can quickly enhance the extraction efficiency of soy protein in AOT reverse micelles.

soy protein; reverse micelles; microwave; forward extraction; response surface methodology

TS201.4

A

1002-6630（2014）10-0088-05

10.7506/spkx1002-6630-201410016

2013-09-17

山东省科技发展计划项目（2011GGC02044）；国家自然科学基金青年科学基金项目（31101389）

赵晓燕（1975—），女，副研究员，博士，研究方向为食品理论与加工应用及生物粉体技术。

E-mail：zhaoxy_2201@163.com

*通信作者：陈相艳（1973—），女，研究员，硕士，研究方向为农产品精深加工。E-mail：chenxy@saas.ac.cn