基于高效薄层色谱法的胡麻卵磷脂质量分析

古再丽努尔·阿尔肯，刘 然，侯俊峰，艾散江·艾海提，关 明*

基于高效薄层色谱法的胡麻卵磷脂质量分析

古再丽努尔·阿尔肯，刘 然，侯俊峰，艾散江·艾海提，关 明*

（新疆师范大学化学化工学院，污染监测与控制重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830054）

目的：建立胡麻卵磷脂的高效薄层色谱质量分析方法。方法：将卵磷脂供试品及磷脂酰胆碱标准品溶于氯仿-甲醇（3∶2，V/V），以氯仿-甲醇-水（65∶25∶4，V/V）为展开系统，考察不同显色剂、展开系统、点样量、薄层板、检视方式、温度、相对湿度对卵磷脂供试品中不同组分分离的影响，进行高效薄层色谱定性分析；在确定的色谱条件下，将卵磷脂供试品及磷脂酰胆碱标准品进行展开，扫描磷脂酰胆碱峰面积，绘制标准曲线，外标法测定卵磷脂供试品中磷脂酰胆碱的含量。结果：卵磷脂供试品各组分分离情况良好，适于定性分析；卵磷脂供试品中磷脂酰胆碱的含量为63.33%，板间、板内精密度实验相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）分别为1.82%和3.73%，稳定性实验RSD为1.60%，加标平均回收率为98.5%。结论：建立的方法快速准确、重复性好，可为卵磷脂质量分析提供新的技术参考。

卵磷脂；高效薄层色谱法；磷脂酰胆碱；质量分析

卵磷脂是磷脂类混合物，既能促进胆固醇及脂肪的代谢，又有调节高级神经组织活动的作用，可用于减肥、护肤及延缓衰老等方面的应用。除此外，卵磷脂还可表面活性剂、乳化剂等在食品工业中用途更为广泛[1-2]。我国高纯度卵磷脂主要依赖大量进口，以高纯度药用卵磷脂研制的抗癌新药“139”针剂，在国内医药行业市场更是供不应求，其开发是我国医药科技“十五”计划及2010年发展规划的重要任务[3]。卵磷脂的质量分析方法主要有分光光度法[4-8]、红外光谱法[9]、薄层色谱法[10-12]、高效液相色谱法[13-19]、高效毛细管电泳法[20]、柱层析法[21]、氧弹燃烧-灰化分光光度法[22]、以及核磁共振光谱法等[23-24]。目前，主要采用薄层色谱法和高效液相色谱法对卵磷脂中的主要成分磷脂酰胆碱（phosphatidyl choline，PC）进行定性定量分析。高效液相色谱法具有快速、自动化等特点，但试剂及色谱柱较为昂贵，实验成本相对较高；薄层色谱法实验成本相对较低，分离条件易掌握，而且结果直观[10]。

新疆地区在生产胡麻植物油的同时也生产出了胡麻油脚等副产品，油脚是生产卵磷脂的主要原料，胡麻油脚中PC的含量高，可与大豆油脚相媲美[9]，但缺乏深度开发与利用。本实验采用高效薄层色谱法，对从胡麻油脚中制备的卵磷脂进行PC的定性、定量分析，并进行了方法学考察与耐受性实验，旨在为新疆胡麻资源的综合利用、胡麻油脚原材料的精深加工及胡麻油脚卵磷脂产品的质量分析与控制提供参考依据，以期提高新疆地区油脂类食品工业经济效益。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

胡麻卵磷脂供试品（课题组精制）；甲醇、丙酮、冰醋酸 天津市福晨化学试剂厂；氯仿、无水乙醇天津市富宇精细化工有限公司；三乙胺、硫酸（均为分析纯） 西安化学试剂厂；PC标准品（批号P3556，纯度≥99%） 美国Sigma公司；磷钼酸 北京化工厂；碘 西安化学试剂厂；重铬酸钾 天津市光复精细化工研究所。

1.2 仪器与设备

高效薄层色谱仪（Linomat 5点样仪、TLC Scanner 3薄层色谱扫描仪、Reprostar 3薄层色谱摄像仪、TLC Plate Heater Ⅲ 薄层板加热器） 瑞士Camag公司；100 μL微量进样针、双槽展开缸（15 cm×10 cm×20 cm）；硅胶G高效板（规格（长×宽）：20 cm×10 cm；厚度：0.20～0.25 mm） 青岛谱科分离材料有限公司；硅胶G板（规格（长×宽）：20 cm×10 cm；厚度：0.20～0.25 mm） 青岛海洋化工厂；硅胶G板（规格（长×宽）：20 cm×10 cm；厚度：0.20～0.25 mm）、硅胶GF254板（规格（长×宽）：20 cm×10 cm；厚度：0.20～0.25 mm） 自制。

1.3 方法

1.3.1 标准品溶液的制备

准确称取PC标准品10 mg，溶于1 mL氯仿-甲醇（3∶2，V/V）中，制得质量浓度为10 mg/mL的标准品溶液。

1.3.2 供试品溶液的制备

准确称取卵磷脂供试品10 mg，溶于1 mL氯仿-甲醇（3∶2，V/V）中，制得质量浓度为10 mg/mL的供试品溶液。

1.3.3 薄层色谱条件

采用课题组自制硅胶G板，以氯仿-甲醇-水（65∶25∶4，V/V）为展开系统，室温、室内进行展开，以5%磷钼酸-乙醇溶液为显色剂，标准品和供试品的点样量分别为2 μL和4 μL，可见光下检视、拍照。含量测定波长为235 nm，狭缝宽度0.8 mm×0.8 mm，采用背景校正，扫描速率25 mm/s。

2 结果与分析

2.1 薄层色谱条件的确定

2.1.1 展开系统的选择

吸取标准品2 μL与供试品溶液4 μL，点于同一薄层板上，分别以氯仿-甲醇-水（65∶25∶4，V/V）、氯仿-甲醇-冰醋酸（24∶18∶0.04，V/V）、氯仿-无水乙醇-三乙胺-水（10∶13∶5∶3，V/V）、氯仿-甲醇-冰醋酸-丙酮-水（35∶25∶4∶14∶2，V/V）为展开系统，展开8 cm，取出，晾干，显色，105 ℃加热5 min至斑点清晰，可见光下检视、照相，结果见图1。

图1 不同展开系统的薄层色谱图Fig.1 Thin-layer chromatogram using different developing systems

由图1可见，A板中PC斑点清晰、大小适中、无明显拖尾，与相邻斑点保持较好的分离度，分离效果较好；B板展开的PC斑点距离下沿较近，除PC斑点外其他斑点颜色较浅，不便于观察；C板展开显色后未见PC斑点，不利于分析；D板除PC斑点外其他斑点颜色较浅，不便于观察。通过观察PC斑点的分离与拖尾情况，最终确定氯仿-甲醇-水（65∶25∶4，V/V）为最佳展开系统。

2.1.2 显色剂的选择

取5 张展开后的薄层板进行显色，薄层板A放置于充满饱和碘蒸气的密闭容器中，其余薄层板分别喷以4%磷钼酸-乙醇溶液、5%磷钼酸-乙醇溶液、8%磷钼酸-乙醇溶液、55%硫酸（含6%重铬酸钾）溶液显色剂后，105 ℃加热5 min至斑点清晰，可见光下检视、照相，结果见图2。

图2 不同显色剂的薄层色谱图Fig.2 Thin-layer chromatogram using different chromogenic agents

由图2可见，A板采用碘蒸气为显色剂，显色后斑点呈蓝色，但所需显色时间较长，边缘模糊，不利于分析；B板采用55%硫酸（含6%重铬酸钾）溶液为显色剂，显色后斑点呈土黄色，除PC斑点外其他斑点颜色较浅，不便于观察；C板采用4%磷钼酸-乙醇溶液为显色剂，显色后斑点呈深蓝色，除PC斑点外其他斑点颜色较浅，边缘模糊，不利于分析；D板采用5%磷钼酸-乙醇溶液为显色剂，显色后斑点呈深蓝色，且斑点清晰；E板采用8%磷钼酸-乙醇溶液为显色剂，显色后斑点呈深蓝色，且斑点较为清晰，与D板效果接近。通过观察斑点颜色和清晰度，最终确定5%磷钼酸乙醇溶液为最佳显色剂。

2.1.3 点样量的选择

分别吸取标准品与供试品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 μL点样于同一薄层板上，展开显色后，可见光下检视、照相。结果表明：点样量过大时斑点面积过大，颜色过深，拖尾较严重；点样量过小时，斑点颜色过浅，不便于观察。通过观察PC斑点的分离与拖尾情况，最终确定标准品和供试品的点样量分别为2 μL和4 μL。

2.2 耐用性实验

2.2.1 薄层板的考察

分别吸取标准品2 μL与供试品溶液4 μL，点于不同薄层板上，展开显色后，可见光下检视、照相。结果见图3。A板为自制硅胶G板，图中显示PC斑点清晰、大小适中、无明显拖尾，与相邻斑点保持较好的分离度，分离效果较好；B板为青岛海洋硅胶G板，硅胶较薄，斑点偏向边缘，且部分斑点堆积在距离上沿较近处，不利于分析；C板为自制硅胶GF254板，斑点面积较大，距离上沿过近，不利于分析；D板为青岛谱科高效板，硅胶较薄，分离效果与A板接近。结果发现，在相同的展开系统、显色剂及点样量条件下，不同薄层板薄层色谱图中卵磷脂样品各组分的斑点均得到较好分离，分离效果接近，表明薄层板对斑点分离影响不大，重复性较好，自制硅胶G板完全可以满足实验要求。

图3 不同薄层板的薄层色谱图Fig.3 Thin-layer chromatograms using different thin layer plates

2.2.2 检视方式的考察

分别吸取标准品2 μL与供试品溶液4 μL，点于同一薄层板上，展开显色后，分别在可见光、紫外光254 nm和366 nm波长处检视、照相。结果见图4。

图4 不同检视方式的薄层色谱图Fig.4 Thin-layer chromatograms observed at different wavelengths

由图4可见，不同检视情况下，色谱图中的斑点呈现未见明显差别，比较而言，可见光下检视的斑点更为清晰，对比度更明显，表明不同检视方式对色谱分析影响不大，重复性较好，选择可见光下检视效果更好。

2.2.3 温度考察

分别吸取标准品2 μL与供试品溶液4 μL，点于同一薄层板上，于4 ℃、室温（约20 ℃）、35 ℃条件下，展开显色后，可见光下检视、照相。结果见图5及表1。A板在4 ℃条件下展开，板上沿产生波纹，斑点出现较为明显的拖尾，不利于分析，而且4 ℃这一环境并不便于在任何季节随时创造；B板在室温条件下展开，展开后PC斑点清晰、大小适中、无明显拖尾，与相邻斑点保持较好的分离度，分离效果较好；C板在35 ℃条件下展开，斑点边缘模糊，展开距离较长，不利于分析。通过观察斑点分离情况并计算PC斑点的Rf，结果表明，在4～35 ℃范围内，温度对各组分的分离有一定影响，选择在室温条件下展开效果更好。

图5 不同温度的薄层色谱图Fig.5 Thin-layer chromatograms at different temperatures

表1 不同温度对PC比移值的影响Table 1 Effect of different temperatures on Rf of phosphatidylcholine

2.2.4 不同相对湿度的考察

分别吸取标准品2 μL与供试品溶液4 μL，点于同一薄层板上，于室内环境（相对湿度（relative humidity，RH）约为22%～26%）、RH 42%和65%条件下，展开显色后，可见光下检视，照相。结果见图6和表2。A板在室内环境下展开，展开后PC斑点清晰、大小适中、无明显拖尾，与相邻斑点保持较好的分离度，分离效果较好；B板在RH 42%条件下展开，展开系统受湿度影响在板上沿产生波纹，斑点形状不规则，拖尾较明显，不利于分析；C板在RH 65%下展开，斑点堆积，不利于分析。通过观察斑点分离情况并计算PC斑点的Rf，结果表明，湿度对各组分的分离影响较大，选择在室内环境下展开可以满足实验要求。

图6 不同相对湿度的薄层色谱图Fig.6 Thin-layer chromatograms at different humidity levels

表2 不同相对湿度对PC比移值的影响Table 2 Effect of different humidity levels on Rf of phosphatidylcholine

2.3 系统验证

以最佳色谱条件进行系统验证。即采用课题组自制硅胶G板，以氯仿-甲醇-水（65∶25∶4，V/V）为展开系统，室温、室内环境下展开，以5%磷钼酸-乙醇溶液为显色剂，标准品和供试品的点样量分别为2 μL和4 μL，可见光下进行检视、拍照。结果见图7。结果表明，供试品中的PC在与标准品相应的位置上，显示相同颜色的斑点，而且分离效果良好，可以满足定性、定量分析的要求。

图7 系统验证色谱图Fig.7 Thin-layer chromatogram from the system verification

2.4 PC含量测定

2.4.1 标准曲线的绘制

准确吸取标准品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 μL分别点于薄层板上，展开，紫外灯下定位，扫描PC斑点峰面积。以PC含量（x）为横坐标，PC峰面积（y）为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程：y=817.54x＋102.35，r=0.999 9。结果表明，在5.0～30.0 μg范围内PC含量与其斑点峰面积呈良好的线性关系。

2.4.2 精密度实验

准确吸取供试品溶液4 μL，依次于同一薄层板上点5 次供试品溶液，重复操作5 次，制得5 块薄层板，分别展开，紫外灯下定位，扫描测定PC斑点峰面积，分别计算板内、板间相同位置PC斑点峰面积的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），板内及板间精密度RSD分别为1.82%和3.73%，表明仪器具有良好的精密度和重复性。

2.4.3 稳定性实验

准确吸取供试品溶液4 μL，点于同一薄层板上，展开，紫外灯下定位，每隔10 min扫描测定一次PC斑点峰面积，计算1 h内峰面积的RSD，结果表明，RSD为1.60%，卵磷脂在1 h内测定结果稳定。

2.4.4 样品测定

分别准确吸取标准品溶液和供试品溶液各2 μL，点于同一薄层板上，按标准曲线项下展开，用外标法计算供试品中PC含量。结果见表3，供试品中PC含量为63.33%，RSD为3.72%。

表3 样品测定结果（n=5）Table 3 Results of replicate determinations of PC in the sample (n=5)

2.4.5 回收率实验

准确吸取3 份供试品溶液1.0 μL，在供试品溶液中分别加入0.8、1.0、1.2 μL标准品溶液，平行操作3 次，分别展开，紫外灯下定位，扫描测定PC斑点峰面积，用外标法计算。结果见表4，平均回收率为98.5%，RSD为3.89%，表明本实验回收率良好，方法准确度高。

表4 回收率实验结果Table 4 Results of recovery tests

3 结 论

利用高效薄层色谱法，在考察不同展开系统、显色剂、点样量、薄层板、检视方式、温度、相对湿度等条件对卵磷脂不同组分薄层色谱分离影响的基础上，筛选确定了最佳展开条件，对卵磷脂供试品进行了较为系统的质量分析，建立了胡麻油脚卵磷脂质量分析的新方法。与高效液相色谱法[13-19]及高效毛细管电泳法[20]相比，本实验建立的方法色谱分离条件易掌握，实验成本明显降低。与薄层色谱分析[10]对比，本实验获得的薄层色谱图各组分分离情况吻合，且PC与其他组分分离效果较好，斑点清晰，结果直观，便于定性分析；比较薄层扫描法[11-12]，本实验的高效薄层定量分析方法更为简便快捷，且精密度及稳定性良好、准确度高，为高效薄层色谱法应用于磷脂类混合物的定量分析提供了技术参考。

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Quality Analysis of Flax Lecithin Based on High Performance Thin Layer Chromatography

GUZAILINUER Aerken, LIU Ran, HOU Jun-feng, AISANJIANG Aihaiti, GUAN Ming*
(Key Laboratory of Pollution Monitoring and Control, College of Chemistry and Chemical Engineering, Xinjiang Normal University, Ürümqi 830054, China)

Objective: To establish a method for the quality analysis of lecithin extracted from flax by high performance thin layer chromatography (HPTLC). Methods: Test samples of lecithin and phosphatidylcholine standard were dissolved separately in chloroform-methanol (3:2, V/V) before analysis by HPTLC. The developing system consisted of chloroform, methanol and water (65:25:4, V/V). The effects of chromogenic agents, developing systems, amounts of spotted sample, thin layer chromatography plates, temperature and relative humidity on the separation of each component in sample were investigated. Under the best chromatography condition, the lecithin in the sample and the standard were developed, and the peak area of phosphatidylcholine was scanned. A standard curve was established and phosphatidylcholine in sample was quantified by an external standard method. Results: The separation of each component in sample was suitable for qualitative analysis. The average content of phosphatidylcholine in lecithin sample was 63.33% with plate-to-plate and within-plate precision (relative standard deviation, RSD) of 1.82% and 3.73%, respectively, and stability (RSD) of 1.60%, and the average recovery was 98.5%. Conclusion: The method is rapid, accurate and reproducible, which can provide a new technical reference for the quality analysis of lecithin.

lecithin; high performance thin layer chromatography; phosphatidylcholine; quality analysis

TS207.3

A

1002-6630（2014）16-0160-05

10.7506/spkx1002-6630-201416031

2013-10-19

新疆维吾尔自治区自然科学基金项目（2011211A031）；新疆师范大学研究生科技创新项目

古再丽努尔·阿尔肯（1990—），女，硕士研究生，研究方向为天然产物分离与分析。E-mail：657301650@qq.com

*通信作者：关明（1974—），男，教授，博士，研究方向为资源植物化学。E-mail：guanm@xjnu.edu.cn