顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用法分析黑茶香气成分

李建勋，杜丽平*，王 超，李 玮，李 桃，肖冬光

（工业发酵微生物教育部重点实验室（天津科技大学），天津市工业微生物重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457）

顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用法分析黑茶香气成分

李建勋，杜丽平*，王 超，李 玮，李 桃，肖冬光

（工业发酵微生物教育部重点实验室（天津科技大学），天津市工业微生物重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457）

利用顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱联用技术分别对普洱茶、六堡茶和安化黑茶3种典型黑茶的香气成分进行分析。结果表明：从普洱茶中鉴定出香气成分66种，六堡茶和安化黑茶鉴定出香气成分均为67种，其中醇类、醛类、酮类、酯类、酚类、碳氢类、含氮类、杂氧类物质含量分别占普洱茶香气成分总含量的6.48%、4.17%、6.30%、6.09%、3.90%、10.58%、7.11%、37.24%；醇类、醛类、酮类、酸类、酯类、酚类、碳氢类、含氮类、杂氧类物质分别占六堡茶香气成分总含量的6.03%、6.60%、11.50%、0.27%、5.00%、6.00%、9. 15%、9.73%、24.69%；在安化黑茶中分别占11.26%、3.00%、13.27%、0.48%、25.63%、3.60%、14.11%、11.11%、4.86%。通过比较分析，普洱茶和六堡茶香气成分相近，富含具有陈香香韵的甲氧基苯类物质，安化黑茶中酯类物质含量最高，表现出花果香香韵。

顶空固相微萃取；气相色谱-质谱联用；黑茶；香气成分

黑茶是我国特有的茶类，属于后发酵茶[1]，制茶工艺一般包括杀青、揉捻、渥堆和干燥4道工序。黑茶主要分布为云南、湖南、广西、四川、湖北[2]，其中云南普洱茶、广西六堡茶和安化黑茶每年产量与销售很大，是黑茶中的代表。

茶叶香气是衡量茶叶品质的重要因素之一，也是鉴别茶叶品种的主要指标[3-4]。顶空固相微萃取（headspacesolid-phase micro-extraction，HS-SPME）用于茶叶 香气成分检测，具有简单、快速、灵敏度高、选择性好的优点[5-6]。实践证明，HS-SPME与气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）可快速分析出茶叶香气物质的组成，已成功应用于绿茶[7-9]、乌龙茶[10-12]、红茶[13-14]和普洱茶[15]香气成分分析，本实验采用HS-SPME与GC-MS分析云南普洱茶、广西六堡茶和湖南安化黑茶3种典型黑茶的香气成分，比较3者的异同，旨在探明不同黑茶香气物质的组成特点，为进一步研究黑茶的品质化学提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大益普洱茶 云南勐海茶厂；安化黑茶 湖南安化茶厂；六堡茶 广西梧州茶厂。

1.2 仪器与设备

手动固相微萃取进样手柄、65 μm PDMS/DVB固相微萃取萃取头 美国Supelco公司；6890A-5973C型气-质联用仪 美国Agilent公司；IT-09A5磁力搅拌器 上海一恒科学仪器有限公司；FA2004电子天平 上海精密科学仪器有限公司；150 mL顶空萃取瓶 天津市东科仪器设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 SPME

称取4 g茶样和3.6 g NaCl加入到150 mL顶空萃取瓶，加入12 mL沸蒸馏水，以四氟乙烯封口，70 ℃水浴平衡15 min，插入装有65 μm PDMS/DVB萃取头的手动进样器，吸附60 min后，取出萃取头插入色谱进样口中，250 ℃解吸5 min。

1.3.2 色谱条件

色谱柱：HP-5MS石英毛细管柱（60 m×0.32 mm，0.25 μm）；进样口温度250 ℃；载气为高纯氦气（纯度＞99.999%）；流速1 mL/min；升温程序：起始柱温40 ℃，保持3 min，以3 ℃/min升至160 ℃，保持1 min，再以5 ℃/min升至240 ℃，保持1 min；不分流进样。

1.3.3 质谱条件

电子电离离子源；离子源温度230℃；电子能量70 eV；四极杆温度150 ℃；接口温度280℃；电子倍增器电压1 280 V；扫描范围m/z 40～450。

1.3.4 数据处理

采集到的质谱图与NIST 08标准谱库对照，并结合相关文献[16-21]比对，对化合物进行定性。采用峰面积归一化法计算各化学成分的相对含量。

2 结果与分析

2.1 黑茶茶叶挥发性香气成分鉴定

3种黑茶样品经SPME萃取、GC-MS分析得到总离子流色谱图见图1。

图1 普洱茶（A）、六堡茶（B）和安化黑茶（C）的总离子流图Fig.1 Total ion current chromatograms of Pu-erh tea (A), Liubao tea (B) and Anhua dark tea (C)

表1 普洱茶、六堡茶和安化黑茶的成分鉴定表Table1 Chemical constituents of Pu-erh tea, Liubao tea and Anhua dark tea

续表1

续表1

3种样品中分离鉴定出的香气成分结果见表1。3种黑茶共分离鉴定出97种香气化合物，初步定性的有81种，其中包括11种醇类、12种醛类、15种酮类、1种酸类、7种酯类、5种酚类、16种碳氢类、3种含氮类和11种杂氧类。

普洱茶初步定性化合物共有66种，占色谱流出组分总量的81.87%，相对含量排在前10位的是1,2,3-三甲氧基苯（16.19%）、1,2,4-三甲氧基苯（15.10%）、咖啡因（7.06%）、二氢猕猴桃内酯（2.91%）、2,6,10,14-四甲基-十五烷（2.09%）、1,2,3,4-四甲氧基苯（2.01%）、2,2,6-三甲基-6-乙烯基四氢-2H-呋喃-3-醇（1.72%）、苯甲酮（1.50%）、β-紫罗兰酮（1.46%）和十六烷（1.42%）。

六堡茶共有67种化合物被初步定性，占色谱流出组分总量的78.97%，相对含量排在前10位的是咖啡因（9.67%）、1,2,3-三甲氧基苯（9.01%）、1,2,3-三甲氧基-5-甲基苯（7.41%）、β-紫罗兰酮（4.30%）、二氢猕猴桃内酯（3.86%）、3,4,5-三甲氧基-苯甲醛（3.66%）、2,3,4-三甲氧基苯酚（2.55%）、1,2,3,4-四甲氧基苯（2.02%）、3,4-二甲氧基甲苯（1.93%）和香叶基丙酮（1.83%）。

安化黑茶初步定性化合物共有67种，占色谱流出组分总量的87.32%，相对含量排在前10位的是顺丁烯二酸二丁酯（17.87%）、咖啡因（10.40%）、β-紫罗兰酮（5.33%）、二氢猕猴桃内酯（3.48%）、2,6,10,14-四甲基-十五烷（2.79%）、水杨酸甲酯（2.79%）、香叶基丙酮（2.60%）、十六烷（2.50%）、芳樟醇（2.27%）和雪松醇（2.12%）。

2.2 黑茶茶样的挥发性成分比较

将普洱茶、六堡茶和安化黑茶的挥发性成分按照不同种类化合物进行比较，结果表明3种黑茶存在明显的差异。

普洱茶、六堡茶和安化黑茶的醇类化合物相对含量分别为6.48%、6.03%和11.26%。普洱茶和六堡茶中醇类含量最高的都是2,2,6-三甲基-6-乙烯基四氢-2H-呋喃-3-醇，它和芳樟醇氧化物Ⅱ、α-松油醇、芳樟醇氧化物Ⅰ和芳樟醇一起构成了两茶样醇类物质的主体，安化黑茶醇类物质以芳樟醇、雪松醇、香叶醇和芳樟醇氧化物Ⅱ为主。

普洱茶和安化黑茶的醛类化合物相对含量分别为4.17%和3.00%，低于六堡茶的6.60%。六堡茶醛类化合物以3,4,5-三甲氧基-苯甲醛、2-丁基-2-辛烯醛、β-环柠檬醛、（E）-2-壬烯醛和臧花醛为主，其中3,4,5-三甲氧基-苯甲醛相对含量为3.66%，明显高于普洱茶的1.19%，而安化黑茶中未检测出3,4,5-三甲氧基-苯甲醛；在普洱茶中检测到了六堡茶和安化黑茶未检测到的壬醛。

六堡茶和安化黑茶的酮类化合物相对含量较高，分别达11.5%和13.27%，高于普洱茶的6.30%。其中β-紫罗兰酮在六堡茶和安化黑茶中的相对含量分别为4.30%和5.33%，高于普洱茶的1.46%；在这两茶样中还检测到了普洱茶中未检测到的2,6-二叔丁基-邻苯醌、6-甲基-5-庚烯-2-酮和2,5-二甲基二苯甲酮；二氢-β-紫罗兰酮仅在普洱茶中检测出。

在六堡茶和安化黑茶中均检测到的1种酸类化合物，即壬酸，相对含量分别为0.27%和0.48%，普洱茶中未检测到任何酸类物质。

普洱茶和六堡茶的酯类化合物相对含量分别为6.09%和5.00%，低于安化黑茶的25.63%。安化黑茶中顺丁烯二酸二丁酯含量最高，相对含量为17.87%，远高于普洱茶的0.61%，在六堡茶中未检测到顺丁烯二酸二丁酯；二氢猕猴桃内酯和水杨酸甲酯在安化黑茶中含量也较高，相对含量分别为3.48%和2.79%；其中顺丁烯二酸二丁酯具有淡淡的花果香香气；二氢猕猴桃内酯具有浓郁的果香气息[22]。

普洱茶、六堡茶和安化黑茶的酚类化合物相对含量分别为3.90%、6.00%和3.60%。其中，六堡茶中的2,3,4-三甲氧基苯酚相对含量为2.55%，是含量最高的酚类化合物；3-甲基苯酚是六堡茶独有的酚类化合物。

安化黑茶的碳氢化合物相对含量为14.11%，高于普洱茶和六堡茶的10.58%、9.15%。其中相对含量较高的碳氢化合物有2,6,10,14-四甲基-十五烷、十六烷和十七烷等；柠檬烯是安化黑茶所特有的碳氢化合物；在六堡茶中未检测到普洱茶和安化黑茶中具有木香香韵的β-愈创木烯；2-乙烯基萘只在六堡茶中检测出。

普洱茶、六堡茶和安化黑茶的含氮化合物相对含量分别为7.11%、9.72%和11.11%。其中3种茶中均可检测到咖啡因和N-乙基琥珀酰亚胺2种含氮化合物，并且咖啡因含量比较高；除此之外，在安华黑茶还检测出2,3,5,6-四甲基吡嗪，而普洱茶和六堡茶中未检测到。

普洱茶和六堡茶的杂氧化合物相对含量分别为37.24%和24.69%，远远高于安化黑茶的4.86%，是3种茶中含量差异最明显的1类化合物。这是由于普洱茶中1,2,3-三甲氧基苯和1,2,4-三甲氧基苯2种化合物的相对含量接近其香气总含量的三分之一，六堡茶中1,2,3-三甲氧基苯和1,2,3-三甲氧基-5-甲基苯相对含量也分别高达9.01%和7.41%，而安化黑茶中除了1,2,3-三甲氧基苯外，其余甲氧基苯类化合物相对含量都不足1%。这些甲氧基苯类化合物赋予黑茶典型的霉味和陈香，是黑茶沉香甘醇的主要原因[23]，在不发酵绿茶和全发酵红茶中未检测到甲氧基苯类化合物[24]，故甲氧基苯类化合物是黑茶特有的香气成分。

图2 普洱茶、六堡茶和安化黑茶香气组分对比图Fig.2 Comparison of aroma constituents among Pu-erh tea, Liubao tea and Anhua dark tea

由表1和图2可知，不同种类化合物在3种黑茶样品中的相对含量差异十分明显。对3种黑茶挥发性成分按照不同种类化合物进行比较，普洱茶中醇类、醛类、酮类、酯类、酚类、碳氢类、含氮类、杂氧类物质含量分别占色谱流出组分总量的6.48%、4.17%、6.30%、6.09%、3.90%、10.58%、7.11%、37.24%；醇类、醛类、酮类、酸类、酯类、酚类、碳氢类、含氮类、杂氧类物质含量在六堡茶中分别占色谱流出组分总量的6.03%、6.60%、11.50%、0.27%、5.00%、6.00%、9.15%、9.73%、24.69%，在安化黑茶中分别占11.26%、3.00%、13.27%、0.48%、25.63%、3.60%、14.11%、11.11%、4.86%；普洱茶和六堡茶中以甲氧基苯类化合物为代表的杂氧化合物含量最高，而安化黑茶酯类化合物含量最高。

3 结 论

采用SPME结合GC-MS对普洱茶、六堡茶和安化黑茶3种典型黑茶的香气成分进行了分析。3种黑茶共分离出97种香气成分，初步定性的共81种，其中普洱茶66种、六堡茶67种、安化黑茶67种。对香气成分分析结果表明，普洱茶和六堡茶香气成分比较接近，甲氧基苯类化合物含量较高，分别为37.24%和24.69%，甲氧基苯类化合物表现出陈香风味，另外这2种茶中碳氢类物质与含氮类物质的含量也比较高；安化黑茶与普洱茶和六堡茶的香气具有明显差异，安化黑茶中酯类物质含量比较高，为25.63%，此外碳氢类、酮类、醇类、含氮类物质在安化黑茶中含量都相对比较高，该茶具有典型的花果香味；另外，3种茶中二氢猕猴桃内酯和β-紫罗兰酮的相对含量均排在前10位，其中二氢猕猴桃内酯具有强烈的果香香气，β-紫罗兰酮则赋予黑茶木香香味。

茶叶的香气与茶树品种、自然环境与栽培条件、加工工艺和外源诱导等多种因素有关[25]，本研究对3种黑茶的香气成分进行了初步研究，有必要对影响黑茶香气的各种因素进行进一步研究，并结合气相色谱-嗅觉测量法对黑茶香气成分进行分析研究，为提高黑茶产品质量和规范黑茶加工工艺提供依据。

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Analysis of Aroma Compounds in Dark Teas by Head Space-Solid Phase Micro-Extraction Coupled with Gas Chromatography-Mass Spectrometry

LI Jian-xun, DU Li-ping*, WANG Chao, LI Wei, LI Tao, XIAO Dong-guang
(Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology (Tianjin University of Science and Technology), Ministry of Education, Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology, College of Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China)

The aroma components in Pu-erh tea, Liubao tea and Anhua dark tea were analyzed using headspace-solid-phase micro-extraction coupled with gas chromatography-mass spectrometry (HS-SPME-GC-MS). The results showed that 66 aroma components were identified in Pu-erh tea, including alcohols, aldehydes, ketones, esters, phenolic compounds, hydrocarbons, nitrogenous compounds and heterocyclic oxygen compounds, which accounted for 6.48%, 4.17%, 6.30%, 6.09%, 3.90%, 10.58%, 7.11%, and 37.24% of the total amount of aroma compounds, respectively; and 67 in Liubao tea and Anhua dark tea, resp ectively. The content s of alcohols, aldehydes, ketones, acids, esters, phenolic compounds, hydrocarbons, nitrogenous compounds and heterocyclic oxygen compounds in relation to the total amount of the aroma compounds identified in Liubao tea were 6.03%, 6.60%, 11.50%, 0.27%, 5.00%, 6.00%, 9.15%, 9.73%, and 24.69% whereas in Anh ua dark tea they were 11.26%, 3.00%, 13.27%, 0.48%, 25.63%, 3.60%, 14.11%, 11.11%, and 4.86%, respectively. In comparison, the aroma characteristics of Pu-erh tea and Liubao tea were similar, both being rich in methoxybenzene compounds, which was responsible for the stale flavor. Esters were the most abundant aroma compounds in Anhua dark tea, which contributed to the floral and fruity aroma.

headspace-solid-phase micro-extraction (HS-SPME)；gas chromatograph-mass spectrometry (GC-MS)；dark tea；aroma components

TS272

A

1002-6630（2014）02-0191-05

10.7506/spkx1002-6630-201402036

2013-03-03

教育部“长江学者和创新团队发展计划”项目（IRT1166）

李建勋（1987—），男，硕士研究生，研究方向为生物分离工程。E-mail：lijianxun12345@126.com

*通信作者：杜丽平（1967—），女，副教授，博士，研究方向为发酵工程与分离工程。E-mail：dlp123@tust.edu.cn