经典恒温加速试验法预测健脑益智胶囊的有效期

柳小莉 赵晓平 范小璇 侯 文 郭东艳

健脑益智胶囊为陕西中医学院附属医院院内制剂，处方由水蛭、葛根、白茅根、郁金等药味组成。具有化瘀利水，豁痰开窍的功效，临床上主要用于颅脑损伤后脑组织水肿和微循环障碍引起的各种症状。其中水蛭为方中君药，有效成分为水蛭素，水蛭素遇热不稳定，《中国药典》2010 年版一部水蛭项下采用抗凝血酶活性进行定量。因处方中干扰因素较多，不能准确测定其抗凝效价的变化，因而选用臣药葛根中的有效成分葛根素为指标成分［1，2］，采用经典恒温加速试验法及高效液相色谱法对其进行含量测定，预测健脑益智胶囊的有效期。

材料与方法

1.仪器:Agilent 高效液相层析仪(美国安捷伦公司);Al204万分之一电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司);BT25s 十万分之一电子天平(上海天美仪器有限公司);501 型超级恒温水浴锅(上海实验仪器有限公司);KH-400KDE 型高功率数控超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)。

2.药材与试剂:健脑益智胶囊(陕西中医学院中药制剂室自制，批号为20120819);葛根素对照品(中国药品生物制品检定研究院，供含量测定用，批号为110752 -200511);甲醇为层析纯;水为重蒸馏水。

3.方法:(1)取样:取健脑益智胶囊150 粒，分成25 份，将各份样品置具塞试管中密封，分别放于60、70、80、90、100℃超级恒温水浴锅中，按各设定时间取出，立即放入水中冷却，备用。(2)葛根素含量测定方法学考察:层析条件:层析柱为Thermo BDS C18(5μm，4.6 ×250nm)，以甲醇-水(25∶75)为流动相;检测波长250nm;流速为1. 0ml/min;柱温为25℃。(3)对照品溶液的制备:取对照品0.87mg，精密称定，加30%乙醇制成每1ml 含87μg 的溶液，即得。(4)供试品溶液的制备:取上述的具塞试管中健脑益智胶囊内容物约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30%乙醇50ml，密塞，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用30%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，用0.45μm 微孔滤膜滤过，即得。(5)标准曲线的绘制:精密吸取对照品溶液(87μg/ml)3ml，定容至10ml 容量瓶中。分别精密吸取2、4、6、8、10、12μl注入液相层析仪，按照优选的层析条件进行测定，以对照品溶液进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归。

结 果

1.葛根素方法学考察结果:按照优选的色谱条件，以对照品溶液进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，标准曲线见表1，不同温度和不同时间条件下，葛根素含量测定结果见表2。以对照品溶液进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，可得回归方程为:y=110.87x-7.12，R=1，说明葛根素浓度在0.0522 ～0.3132μg 范围内，峰面积与浓度呈较好的线性关系。

表1 葛根素对照品标准曲线

2.K 值的计算:以不同时间不同条件下葛根素含量的对数lgc 对时间t 作图，得到各温度下的回归方程，符合一级反应方程式lgC = -kt/2.303 +lgC0，可确定葛根素含量随时间变化符合化学动力学一级反应。再由回归方程斜率求出各温度下药物降解反应速度常数K 值［3］，结果见表2。

表2 不同温度和不同时间条件下葛根素含量的测定结果［3］

3.反应活化能的计算:根据各温度下的KS 值得出lgK，结果见表3。以lgK 对1/T 作图，进行线性回归，得回归方程:lgK = -4669.6 ×1/T +10.639，r =0.9929。由Arrhenius 指数定律:lgK = -E/2.303RT+lgA 及直线斜率求出活化能E =89.463kJ/mol，在(41.84 ～125.52)kJ/mol 范围内，说明用经典恒温法预测室温下葛根素的稳定性有实际意义。

表3 温度与速度常数表

4. 室温下有效期t0.9的计算:将回归方程lgK =-4669.6 ×1/T+10.639(r=0.9929)，外推可得室温25℃(T =273 +25)时的K25℃=9.32 ×10-6/h，从而可计算出在室温25℃下有效成分减少10%所需的时间，即有效期t0.9，t0.9=0.1054/K25℃=11309h =1.29a(年)。

讨 论

采用经典恒温加速试验法预测健脑益智胶囊的有效期，设置了试验的温度和时间，试验过程中可观察到，随着温度升高，时间延长样品颜色加深，其中100℃下样品的颜色最深。经高效液相层析法测得的含量随着温度升高，时间延长，葛根素含量逐渐降低。经试验，在密闭条件下，预测健脑益智胶囊有效期为1.29 年，有效期时间偏短。关于健脑益智胶囊的有效期还有待于结合长期留样观察法结果进一步进行确定。

1 潘平康，张超，吴海琴，等. 葛根素对大鼠脑缺血后海马中EPO 和STAT-5 表达的影响［J］. 卒中与神经疾病，2013，20(3):137 -140

2 梅志刚，王明智，刘晓洁，等. 葛根素对大鼠脑缺血再灌注损伤α7nAChR、NF-κB p65 及STAT3 mRNA 表达的影响［J］. 中华中医药杂志，2013，28(1):113 -117

3 洪清，袁曦，王友芳，等. 多元线性模型和经典恒温法预测天宁滴丸有效期［J］. 中国现代应用药学，2013，30 (4):416 -419