提高白藜芦醇含量的桑椹酒酿制方法

朱祥瑞，杨逸文，占鹏飞，章本学，沈建栋

（1.浙江大学应用生物资源研究所，浙江 杭州 310058；2.安吉县超龙蚕业发展有限公司，浙江 湖州 313300；3.湖州市农业科学研究院，浙江 湖州 313060；4.湖州市南浔尚豪蚕桑专业合作社，浙江 湖州 313000）

提高白藜芦醇含量的桑椹酒酿制方法

朱祥瑞1，杨逸文2，占鹏飞3，章本学2，沈建栋4

（1.浙江大学应用生物资源研究所，浙江 杭州 310058；2.安吉县超龙蚕业发展有限公司，浙江 湖州 313300；3.湖州市农业科学研究院，浙江 湖州 313060；4.湖州市南浔尚豪蚕桑专业合作社，浙江 湖州 313000）

为了检测额外添加桑椹果皮、3种不同酵母、发酵温度和发酵时间对于桑椹酒酒中白藜芦醇含量的影响，以湖州市安吉县的大10果桑为原料，进行桑椹酒发酵。采用高效液相色谱（HPLC）对桑椹酒中白藜芦醇进行了检测分析。结果表明：发酵到第4 d，处理A、B、C-1、C-2、C-3和CK发酵液中白藜芦醇含量分别为2.5、3.9、4.3、4.5、4.5和2.7 mg/L；发酵时间从0 h至第96 h，白藜芦醇含量逐渐升高，到96 h时为最高；在26～32℃条件下发酵时，白藜芦醇含量均比较理想，但以28℃比较适宜。酵母对白藜芦醇含量的影响不太有规律。

白藜芦醇；含量；桑椹酒

白藜芦醇（Resveratro1）是植物所含的一种天然的二苯乙烯类化合物，是含有芪类结构的非黄酮类多酚化合物。到目前为止，已证实白藜芦醇只存在于21科31属的72种植物中［1～2］，其资源并不是很丰富，因此挖掘和开发资源，是具有现实意义的工作。

现代药理学研究证明：白藜芦醇具有抗病毒、抑肿瘤、抗氧化、清除自由基、抗诱变、降血脂、保护心血管、延缓衰老、美容等作用，是一种极具开发价值的天然物质［3］，被喻为继“紫杉醇”之后的又一新的绿色抗癌物质。因而其在医药、保健食品领域具有很广阔的开发前景。美国天然药物研究所（CNN）研究发现白藜芦醇还具有抗艾滋病的作用。但目前从天然植物中提取的得率较低，因此研究有效的提取方法具有重要的意义。

桑椹酿制酒中含有一定量的白藜芦醇，在桑椹酒酿制过程中，通过适当的技术处理，尽可能保留更多的白藜芦醇是一项既有现实意义也有理论意义的工作。本试验通过对酿制条件的控制和技术处理，使白藜芦醇含量有所提高。试验工作小结如下。

1 材料与方法

1.1 材料

桑椹：大10成熟果实，2013年5月中旬采摘于安吉县超龙蚕业发展有限公司桑园。

桑椹果皮：2013年5月中旬采摘于安吉县超龙蚕业发展有限公司桑园的大10成熟果实，榨取果汁后的桑椹果皮。

白藜芦醇标准样品：美国Sigma Chemical Co.，LTD产品。

乙腈：美国霍尼韦尔公司（Honeywell）色谱级产品。

酵母：①LAFFORT（拉氟德）F33，法国LAFFORT公司产品；②安琪酿酒酵母RW（葡萄酒专用酵母），安琪酵母股份有限公司；③安琪酿酒酵母SY（果酒专用酵母），安琪酵母股份有限公司。

果胶酶：法国LAFFORT果酒专用果胶酶。

1.2 仪器

LC-6A高效液相色谱仪、UV检测器：日本岛津公司。

色谱柱：Hypersil ODS柱（250 mm×416 mm，5 μm），美国Thermo Scientific公司产品。

分析天平：赛多利斯BSA124S，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司产品。

发酵罐：RAT-5型5 L双层玻璃反应釜，予华仪器有限公司产品。

1.3 方法

1.3.1 白藜芦醇标准样品的制备和标准曲线的绘制

精密称取白藜芦醇标准样品2.5 mg，用无水乙醇溶解并定容于25 ml容量瓶中。

分别吸取白藜芦醇标准样品溶液1.0、2.0、3.0、 4.0、5.0 ml，用无水乙醇定容于100 ml容量瓶中，摇匀，得浓度分别为1、2、3、4、5 mg/L白藜芦醇标准系列。以无水乙醇为空白对照，各进样10 μl，在306 nm波长下进行HPLC分析。

色谱条件：流动相：乙腈/水（35/65）；检测波长：306 nm；柱温：室温；流速：1 ml/min；进样：10 μl。

以样品白藜芦醇量为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y），计算曲线方程（n=5）和相关系数（R2）。

1.3.2 桑椹酒酿制方法

（1）酵母准备：将LAFFORT F33酵母缓慢的加入到其10倍质量的37℃的热水中，搅拌溶解，活化，静置2 min，备用。

（2）原料准备：桑椹用机械破碎后，作以下不同处理：A：破碎后的桑椹，过滤，滤去果皮，取果汁用于酿酒；B：破碎后的桑椹，连果皮一起用于酿酒；C：破碎后的桑椹，连果皮一起用于酿酒，并添加一定比例的桑椹果皮（5%、10%和15%，果皮来自于处理A）一起酿酒。

对于上述处理B和处理C，分别添加LAFFORT果酒专用果胶酶（酶活力为30000 u/g），用量为0.2 g/ L，并适量添加偏重亚硫酸钾，添加量为60 mg/L，充分搅拌。A处理不添加果胶酶。另设对照（CK），即破碎后的桑椹，连果皮一起用于酿酒，但不添加果胶酶。

（3）糖酸度调整：根据桑椹本身糖度以及桑椹酒酒度（10°）要求，添加一定量的食糖，调整桑椹汁糖度至250 g/L。按桑椹酒要求，调整酸度至6 g/L。

（4）发酵：活化后的酵母，按一定比例用量，加入到桑椹汁中充分搅拌，在20～32℃下发酵，当残糖小于5.0 g/L时，结束主发酵［4］。

发酵过程中，每隔24 h抽样，进行白藜芦醇分析。

1.3.3 发酵条件的控制

在不同发酵温度、不同发酵时间以及不同酵母条件下，测定白藜芦醇的含量。

1.3.4 桑椹酒试样的HPLC测定

3.培养联系人的作用未充分发挥。根据问卷调查显示，相当多的入党积极分子认为培养联系人的作用发挥不够明显，培养措施不力，与培养联系人间的沟通交流不多，极个别入党积极分子甚至无法准确说出自己的培养联系人。在影响培养联系人作用发挥的因素方面，大多数认为“工作太忙，联系较少”，其次为“培养教育方式较为生硬”。通过《入党积极分子培养考察登记表》也可以佐证：许多培养联系人对培养考察意见填写内容不够详实、具体，优点多，缺点少，或者只写优点，不写缺点，未能如实反映出入党积极分子期间的表现，并且不能及时将培养考察意见反馈给被培养人。

表1 桑椹酒酿制原料配备表Table 1 List of raw material for brewing mulberry wine

在与测定白藜芦醇标准样品相同的条件下，测试各种处理的桑椹酒白藜芦醇含量。

2 结果与分析

2.1 白藜芦醇的HPLC图谱和标准曲线

SIGMA产的白藜芦醇标准样品的HPLC图谱见图1。

以白藜芦醇标准样品的浓度（mg/L）为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归分析，绘制标准样品的标准曲线见图2。

图1 白藜芦醇标样HPLC图谱Figure 1 HPLC chromatogram of resveratrol standard sample

图2 白藜芦醇标准曲线Figure 2 Standard curve of resveratrol

2.2 不同处理对桑椹酒白藜芦醇含量的影响

桑椹汁（处理A）未添加果胶酶发酵至第4 d的桑椹酒白藜芦醇的HPLC图谱，见图3。

每24 h抽取发酵液样品，比较处理A、处理B和处理C的发酵液中白藜芦醇含量，同时测定对照CK的白藜芦醇含量，结果见图4。

图3 桑椹酒白藜芦醇HPLC图谱（发酵第4 d）Figure 3 HPLC chromatogram of resveratrol in mulberry wine（4thday of fermentation）

图4 不同的处理发酵至第4 d的白藜芦醇含量Figure 4 Resveratrol content in fermentation 4thday

图4显示，有桑椹果皮的（处理B、处理C和对照CK）发酵液中白藜芦醇含量高于不含果皮的（处理A）发酵液；额外添加果皮（处理C）的白藜芦醇含量又高于不添加果皮（处理B）；额外添加果皮的3份材料中，期白藜芦醇含量又以果皮添加多高于添加少的（即C-3＞C-2＞C-1）。而添加果胶酶的桑椹（对照CK）发酵液中白藜芦醇含量高于不添加果胶酶的，说明添加果胶酶，对提高发酵液中白藜芦醇的含量也有一定的作用。

在图3中还可以看到，发酵到第4 d，处理A、B、C-1、C-2、C-3和CK发酵液中白藜芦醇含量分别为2.5、3.9、4.3、4.5、4.5和2.7 mg/L。

2.3 发酵条件对桑椹酒白藜芦醇含量的影响

发酵时间和发酵温度，对白藜芦醇含量也有一定影响。结果见表2和表3。

表2和表3显示，发酵时间和发酵温度对发酵液中白藜芦醇的含量都有一定的关系。从中可以发现，发酵时间从0 h开始到发酵至第96 h，白藜芦醇含量逐渐升高，到96 h时为最高，当继续延长发酵时间后，白藜芦醇含量均有不同程度的下降。

以发酵至第96 h为基准，考察不同温度下发酵液中白藜芦醇含量时发现，26～32℃条件下，白藜芦醇含量均比较理想，但考虑到实际生产因素和桑椹酒成品的品质等因素，以28℃比较适宜。

表2 发酵时间与桑椹酒白藜芦醇含量的关系Table 2 The relation between the time and the resveratrol content （单位：mg/L）

表3 发酵温度与桑椹酒白藜芦醇含量的关系Table 3 The relation between the temperature and the resveratrol content （单位：mg/L）

在28℃、发酵96 h，酵母用量为200mg/L［5］，不同品种酵母发酵后，发酵液中白藜芦醇含量，见图5。

图5 不同酵母发酵后白藜芦醇含量的比较Figure 5 Comparison of resveratrol content

就选用的3种酵母而言，发酵后桑椹酒中的白藜芦醇含量没有规律，在不添加果胶酶的样品里，用安琪SY发酵的桑椹酒中白藜芦醇含量稍高；而添加额外桑椹果皮的，则是用拉氟德F33发酵的桑椹酒中白藜芦醇含量稍高。

3 结果与讨论

（1）额外添加桑椹果皮发酵，可以提高桑椹酒中白藜芦醇的含量。

桑椹酒发酵过程中，桑椹果皮中的部分白藜芦醇会溶解、释放到发酵液中；而额外添加桑椹果皮，也就是利用了这部分桑椹果皮中的白藜芦醇，使这些白藜芦醇能溶解、释放到发酵液中，使发酵液中的白藜芦醇含量得到一定程度的提高。

然而，处理C-3与处理C-2之间，白藜芦醇的含量相差不大，考虑到后道工序处理的问题，C-2可以作为比较合适的选择。

（2）发酵条件的不同，桑椹酒中白藜芦醇的含量也会有所不同。

从发酵时间来看，发酵至96 h后，白藜芦醇含量呈现最高值，如果发酵至96 h时主发酵已经完成，则可以考虑96 h为比较合适的发酵时间。同理，在发酵工艺设计的时候，也应该考虑到96 h的发酵时间为白藜芦醇含量最高的时间点，应尽量考虑发酵到96 h左右，完成主发酵。

发酵温度从20℃到32℃之间，随着发酵温度的提高，白藜芦醇含量也随之提高，这可能是在较高的发酵温度有利于桑椹果皮中白藜芦醇的释放。但考虑到温度过高，会对桑椹酒的香气和乙醇造成一定的损失，因此结合感官品质等因素，考虑以28℃比较适宜。

（3）利用其他方法，提高白藜芦醇含量。

前文［5］已报道过，通过紫外线照射桑椹也可以提高桑椹白藜芦醇含量。考虑到这些因素，可以综合各种处理方法，使得桑椹酒中白藜芦醇含量得以提高。

［1］Jang M.，Cai L.，Udeani G.O.，et al．Cancer chemopreven⁃tive activity of resveratrol，a natural product derived from grapes［J］.Science，1997，275：218～200.

［2］Hain Ruediger，Reif Hans-Joerg，Krause Elvira，et al．Disease resistance results from foreign phytoalexin ex⁃pression in a novel plant［J］.Nature，1993，361（6408）：153～156.

［3］Sun NT，Woo SH，Cassady JM，et al.DNA polymerase and topoisomerase II inhibitors from psoralea corylifolia［J］.J Nat Prod，1998，（61）：362～366.

［4］马佩选.葡萄酒质量与检验［M］.北京：中国轻工业出版社，2002.

［5］朱祥瑞，章本学，杨逸文，等.桑椹及桑椹酒白藜芦醇的含量变化［J］.蚕桑通报，2013，（44）3：32～35.

Brewing Method of Increase Resveratrol Content in Mulberry Wine

ZHU Xiang-rui1,YANG Yi-wen2,ZHAN Peng-fei3,ZHANG Ben-xue2,SHEN Jian-dong4
（1.Institute of Applied Bioresources,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China;
2.Anji Chaolong Sericultural Development Company,Anji 313300 Zhejiang,China;
3.Huzhou Academy of Agricultural Science,Huzhou 3130600 Zhejiang,China;
4.Shanghao Sericultural Professional Cooperatio,Nanxun 313000 Zhejiang,China;）

In order to explore effect of adding mulberry bark,3 saccharomyces cerevisiae,fermentation temperature,fer⁃mentation time on contents of resveratrol in mulberry wine,variety Da 10 of mulberry from Anji of Huzhou city were used as raw material to make wine,the resveratrol in the wine was detected by HPLC.The result showed that ferment⁃ing to 4th day,the resveratrol contents of treatment A、B、C-1、C-2、C-3 and CK in wines respectively were 2.5、3.9、4.3、4.5、4.5 and 2.7 mg/L;fermentation time from 0 to 96 hours,the resveratrol contents was raised gradually,it was to high⁃est in 96 th hours;fermentation temperature from 26～32℃,the resveratrol contents all are fine,but the 28℃was bet⁃ter;The effect of saccharomyces cerevisiae on resveratrol contents in mulberry wine was irregular.

resveratrol;content;mulberry wine

S886.9

A

0258-4069［2014］01-026-04

湖州市科技局攻关计划农业项目（2012C22154）

朱祥瑞（1957-），博士，副教授。主要从事蚕业资源开发利用的教学科研和推广。E-mail：xrzhu@zju.edu.cn