检测桑叶农药残留的酶抑制速测卡筛选与应用

孙海燕，陈伟国，张芬，杨一平

（海宁市蚕桑技术服务站，浙江海宁 314400）

检测桑叶农药残留的酶抑制速测卡筛选与应用

孙海燕，陈伟国，张芬，杨一平

（海宁市蚕桑技术服务站，浙江海宁 314400）

采用农药残留速测卡检测和养蚕生物试验对比，筛选出适合桑叶农药残留快速检测的酶抑制速测卡，并建立了10种有机磷和氨基甲酸酯类农药的速测卡检测校准参考值，为速测卡应用于养蚕生产中预防桑叶农药残留超标提供了参考。

酶抑制；速测卡；桑叶；农药残留

近年来，随着农药种类和使用量的不断增多，农药污染对养蚕危害的问题日趋凸显。2006年海宁、桐乡蚕区因收蚁期间稻田使用毒死蜱农药污染桑园，造成近8万张蚕种中毒；2007年春蚕期钱江生化生产阿维菌素污染海宁、嘉兴和海盐交界地区桑园，3龄蚕开始发生大面积中毒，损失6348张。零星或小范围的养蚕农药中毒更是数不胜数，程度轻的尚可挽回一些损失，中毒重的甚至出现绝收。要减少养蚕农药中毒损失，除了有关部门加强农药质量管理和规范使用指导外，对蚕桑技术部门来说，需要对桑叶进行必要的农残监测，以便于提早发现桑叶中是否含有较高的农药残留，避免家蚕因食用农残超标的桑叶而引起中毒。

酶抑制法快速检测技术是利用农药残留量对胆碱酯酶抑制率的相关性原理，通过显色反应表现检测结果，携带方便的快速检测卡已在蔬菜、水果农药残留速测上应用较多，在国家标准GB/T 5009.199—2003《蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量快速检测》中明确了检测方法［1-3］。酶抑制速测卡的检测对象是目前使用量大、毒性较高的有机磷和氨基甲酸酯两大类农药。为将这一技术应用于养蚕生产预防农药中毒事故，我们对多种农药残留速测卡检测桑叶农残反应进行了对比筛选，结合家蚕生物毒性试验建立常用农药在桑叶上残留检测反应校准参数，提高其实用性和可靠性，现将初步试验结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 供试材料

农药速测卡：市场供应的5种酶抑制农药残留速测卡产品供试，见表1。

供试农药：酶抑制法农药残留检测对象是有机磷和氨基甲酸酯两类农药，从中选择了在桑园和周围其它农作物中常用的10种农药，见表2。

供试桑树：3年生盆栽桑，强桑1号和农桑14号，树形矮小，方便农药处理。

供试蚕品种：白玉×秋丰，3龄起蚕。

1.2 试验方法

1.2.1 农药处理

40%乐果乳油、45%马拉硫磷乳油、77.5%敌敌畏乳油、40%辛硫磷乳油、20%亚胺硫磷乳油均为1000倍稀释液，90%敌百虫晶体、40%毒死蜱乳油、20%灭多威乳油、8%残杀威可湿性粉剂、20%丁硫克百威乳油均为1500倍稀释液。每种农药处理浓度各喷于4株盆栽桑上，桑叶正反面完全喷湿为度。

1.2.2 农药残留速测卡检测方法

上海捷门保林迈生物工程有限公司生产的农药残留快速测试卡使用方法：洗脱液滴于桑叶表面并轻轻摩擦，将桑叶上的液滴滴在加样孔中，预反应10 min后将结果观察孔中的保护片抽出，捏合速测卡上缘使酶片与底物反应，5 min后根据观察孔颜色变化判读检测结果。其它4种农药残留速测卡的使用方法：洗脱液滴于桑叶表面并轻轻摩擦，将桑叶上的液滴滴在白色药片上，10 min后对折速测卡，使红色药片与白色药片叠合发生反应，用手捏紧3 min后根据白色药片的颜色变化判读结果。白色药片变蓝色为阴性，表明农药残留较量低于检测限；不变色或变色不明显为阳性，表明农药残留量达到了检出范围。每种速测卡每次检测时均以洗脱液作空白对照。

1.2.3 对家蚕残毒试验方法

用于农药速测卡检测的同一残毒桑叶样本同时进行家蚕生物试验，以无毒桑叶为空白对照，重复4次，每个小区20头3龄起蚕，48 h后调查各处理的中毒情况并计算死亡率。

2 试验结果

2.1 农药残留测试卡的筛选

通过5种速测卡对10种农药的检测反应，与家蚕残毒饲养试验结果对比，不同速测卡对供试农药的检测反应存在较大差异。3号、4号、5号速测卡的灵敏度明显低于养蚕生物试验；2号速测卡对敌百虫和丁硫克百威的检测反应最强，但对其余8种农药的测试反应低于1号测试卡；1号速测卡与养蚕生物试验最为接近。根据检测对比结果综合评价，1号速测卡（上海捷门保林迈生物工程有限公司生产的农药残留快速测试卡）最佳，2号速测卡（广州新原生物技术有限公司生产的高灵敏度农药速测卡）次之。

表1 供试酶抑制农药残留速测卡Table 1 The pesticide residue fast detecting cards with enzyme inhibition

再从1号速测卡和2号速测卡的保存要求、包装方式等进一步比较。由于酶抑制农药残留速测卡具有生物活性成份，忌光、热、潮湿，要求在4℃冰箱中保存，拆开密封包装袋后最好在1 W内用完。1号速测卡最小包装为2片，恰好满足一次使用，1片为农药残留样本测试，1片为空白对照测试。而2号速测卡的10片包装如短时间内不能用完，会产生不必要的浪费。据此，选定上海捷门保林迈生物工程有限公司生产的农药残留快速测试卡为桑叶农药残留检测品种。

2.2 测试结果与校准

从表3可看出，40%乐果乳油、45%马拉硫磷乳油、77.5%敌敌畏乳油、40%辛硫磷乳油、20%亚胺硫磷乳油的1000倍稀释液喷于桑叶后，对3龄起蚕的残毒期不超过5 d。采用上海捷门保林迈农药残留快速测试卡检测同一桑叶样本，阳性反应的间隔天数均大于对3龄起蚕的残毒期，表明检测灵敏度高于养蚕生物试验；但对不同农药品种的反应差异较大，其中40%乐果乳油1000倍和45%马拉硫磷乳油1000倍喷药后1 d对3龄起蚕无中毒反应，测试卡的阳性反应分别为喷药后3 d和5 d；20%亚胺硫磷乳油1000倍喷药后3 d对3龄起蚕无中毒反应，而速测卡阳性反应持续到喷药后7 d，两者的差值最大。

由表4可见，90%敌百虫晶体1500倍喷药后12 d的桑叶对3龄起蚕无急性毒性表现，速测卡检测为阴性，两者结果一致；20%灭多威乳油和8%残杀威可湿性粉剂1500倍喷药后13 d的桑叶，速测卡检测结果均为阴性，对3龄起蚕无中毒症状分别在12 d和14 d，正负各差1 d；40%毒死蜱乳油1500倍喷药后17 d的桑叶对3龄起蚕无急性毒性表现，速测卡的阳性检测限为15 d；20%丁硫克百威乳油1500倍对3龄起蚕的残毒期为21 d，速测卡检测出阴性则在20 d。

表35 种短残留农药的速测卡检测结果与生物毒性对照Table 35 short residual pesticide fast test card test results

表45 种中长残留农药的速测卡检测结果与生物毒性对照Table 45 long residual pesticide fast test card test results

根据10种供试农药的速测卡检测结果与3龄起蚕生物毒性试验对比值（表5），提出相应的校准参考值。由表5可见，速测卡检测出转阴性与对3龄起蚕无急性中毒间隔天数的差值表现出一定的规律性，对家蚕残毒期短的农药，速测卡检测的灵敏度更高；对家蚕残毒期较长的农药，速测卡的检测限则偏低；其原因既与速测卡对不同农药的生物反应差异有关，也与不同农药对家蚕的毒性差异有关。对于明确的单一农药可参照表5校准速测卡检测。

3 小结与讨论

3.1 酶抑制速测卡的主要优点

酶抑制法农药残留速测卡具有操作简便、不需要配制试剂、不需要专业的技术培训，方便贮存和携带等优点。试验结果表明，对生产中常用的有机磷和氨基甲酸酯两类10种农药都能够进行有效检测。而有机磷类和氨基甲酸酯类农药是目前国内生产量最大、品种最多、使用频率最高的农药［2］。因此，测试卡的检测应用范围很广，可用于养蚕生产中预防桑叶农药残留超标的现场快速初筛检测，也可作为农药中毒事故现场诊断的辅助手段。

3.2 酶抑制速测卡的限制因素

酶抑制检测原理仅对有机磷和氨基甲酸酯两类农药有效，而且不同种类农药对农药速测卡的呈色反应灵敏度不同［4］。酶抑农药残留速测卡具有生物活性，一般要求在4～10℃条件下冷藏保存，否则因酶的活性降低而失效。由于农药速测卡法显色反应灵敏度与农药的种类有关，检测结果不能保证所检桑叶样本对家蚕安全，因此，最好配合生物试验等措施来预防养蚕中毒事故。

3.3 酶抑制速测卡检测桑叶农残的应用评价

从本试验结果看，酶抑制速测卡对短残毒农药的检测灵敏度高于养蚕生物试验，对养蚕安全是有利的，但也可能带来不必要的误测误报；对中长残毒农药的检测灵敏度与养蚕生物试验相差约±1～2 d，表明两者吻合度较高。再从生产实际分析，桑园施用短残毒农药往往在距蚕期较近，用药谨慎度较高，安全间隔期相对稳定可控，一般不须进行针对性检测；而中长残留农药的残毒期受多种因素影响表现出波动，是养蚕生产中导致中毒损失的主要素之一，因此，进行针对性的残留毒性检测十分必要，具有较高的实用价值。

［1］陈胜，刘立群，周辉棠，等.农药速测卡的研制与应用［J］.检验检疫科学，2000，10（2）：1～3.

［2］王多加，胡祥娜，周向阳，等.蔬菜农药残留快速检测技术—胆碱酯酶速测卡法［J.食品科学，2003，24（6）：109～113.

［3］许美玲，刘仲昌.农药速测卡与气相色谱法测定蔬菜中有机磷农药残留量的比较［J］.临床和实验医学杂志，2006，5（5）：576～577.

［4］张英，乔方，孔文，等.农药速测卡法和气相色谱——质谱联用法分析蔬菜中有机磷农药［J］.深圳职业技术学院学报，2003，2（4）：21～25.

Selection and Application of Pesticide Residue Fast Detecting Cards with Enzyme Inhibition for Mulberry Leaves

SUN Hai-yan,CHEN Wei-guo,ZHANG Fen,YANG Yi-ping
（Haining Sericultural Technics Service,Haining 314400 Zhejiang,China）

The detection results of pesticide residue fast detecting cards were contrasted with biological test results of silkworm rearing.And the pesticide residue fast detecting cards with enzyme inhibition especially suitable for mulberry leaves detection were chosen.And the calibration of reference value of 10 organophosphorus and carbamate pesticides were determined.

enzyme inhibition;fast detecting card;mulberry leaf;pesticide residue

S884.9

A

0258-4069［2014］03-012-04

浙江省重点科技创新团队项目（2011R50028-19）

孙海燕（1980-），男，浙江海宁人，农艺师，从事蚕桑技术推广工作。E-mail：sunhy123@hotmail.com